不想再被科研实验拖累？因它，隔壁科室医生一年拿下几篇SCI！
解螺旋公众号·陪伴你科研的第2507天
快被实验逼疯的科研人别走！！！
有一期《奇葩说》的辩题是——“频繁被渣，是不是我的问题？”
让我想到很多临床医生诸多抱怨——“实验结果衰到掉渣，到底是不是我的问题？”
这其中，不乏很多医生/医学生，初到实验室时，信心满满，干劲十足！
取样、实验、出数据、写论文，即便是称量时刻，都恨不得秀一把骚操作！在预想的流程中，一切都是这么天衣无缝、完美无缺！
然而，现实骨感，不到半年就铩羽而归！
在与科研实验的相爱相杀中，好的实验结果就如同海市蜃楼一般，看似近在眼前，却怎么都触及不到；
而各种糟心的实验结果却是前赴后继、接踵而来——
细胞完全不受控，开心了就一天长爆，抑郁了就三天不长，一言不合就污染！细菌胶虫支原体，你方唱罢我登场，搅得细胞不得安宁！
分子实验的拖尾弥散呈S型的条带就是不如别人家的酷炫！而阴性结果更是阴魂不散，如何不让人心力交瘁、内心空洞。
这波浪潮来势凶猛，简直分分钟就要把临床医学狗们拍死在沙滩上。
其实，临床医生们未必不优秀，毕竟当初轮转过无数科室，临床操作也是抬手就来。谁成想，优秀的临床医生们，会栽在科研实验这个“坑”中呢？
诚然，大多数临床医学生的基础研究水平并不高，一是时间紧迫，二是缺乏正规系统的科研训练，致使实验操作水平略欠火候，从而导致科研过程中困难重重，鲜有一帆风顺的。
这大概就是临床科研者常常感到心有余而力不足的原因所在。
虽然有些学习能力强医学生在时间精力有限的情况下，也能做到临床、科研两不误。但这毕竟是少数！大部分临床科研者在进行实验操作时都是单打独斗，硬着头皮上阵，完全就是在“踩着石头过河”。
而这说到底，是因为无人告知他们如何才能少走弯路、以及如何才能用最少的时间得到理想的实验结果。
基础科研中实验技术一般可分为核酸技术、蛋白质技术、细胞技术、动物实验技术，此外还有就是重要仪器的使用技术。每一项技术中实验又是林林总总，大有乱花渐欲迷人眼之势。难不成每个实验都要临床医生们从头开始学起么？答案自然是NO！
别看基础科研中的实验琳琅满目，但其实只需要掌握其中最为常用的基础技术如PCR、western blot、ELISA、免疫荧光、流式、激光共聚焦等，基本上就可以在实验室横着走了。
现在，本文就先抛砖引玉，将免疫学领域中一些最常用的实验（western blot、免疫共沉淀、免疫组化及ELISA）Protocol全部奉上，希望大家在新的一年里，在科研上能无往而不利。
Western blot (WB)
WB是通过特异性抗体检测PAGE电泳的蛋白质样品进行着色，并通过分析着色的位置和深度获特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息。
Protocol：
1、从细胞中提取蛋白，并测定蛋白浓度含量。
2、取适量蛋白液与loading buffer（含有SDS和β-巯基乙醇）混合，加热煮沸5min，使蛋白变性且与SDS结合后携带负电。
3、将变性蛋白进行SDS-PAGE胶电泳。在电流的作用下，带负电的蛋白质由上向下在凝胶里移动，且蛋白的分子质量越大，其迁移率越慢。
4、转膜：通过半干法或湿转法将PAGE胶上的蛋白转移至NC膜或PVDF膜上。
5、免疫印迹：封闭—敷抗体。
6、检测方法
免疫共沉淀
免疫共沉淀是利用抗原和抗体的特异性结合及细菌的Protein A或G特异性结合到免疫球蛋白的Fc片段的现象，将靶蛋白从混合体系中沉淀下来。
该实验共包括了3种类型：IP（如染色体免疫共沉淀CHIP）、Co-IP和Pulldown
IP是只利用抗体抗原的特异性结合即可将靶蛋白从混合体系中沉淀下来。其中，CHIP便是由IP技术衍生而来。
Co-IP是在细胞非变性裂解时，蛋白之间的相互作用被保留下来，如果蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。
Pull Down是将靶蛋白的配体固化在亲和树脂上充当一种“诱饵蛋白”，当目的蛋白溶液过柱时，可捕获与之相互作用的目的蛋白，洗脱结合物后通过SDS-PAGE电泳分析即可。
免疫组化
免疫组化是应用免疫学及组织化学原理，对组织切片或细胞标本中的某些化学成分进行原位的定性、定位或定量研究
酶联免疫吸附测定ELISA
ELISA指的是将可溶性的抗原或抗体结合到聚苯乙烯等固相载体上，利用抗原抗体结合专一性进行免疫反应的定性和定量检测方法。
ELISA包括三种类型：间接法、夹心法和竞争性法
间接法（Indirect ELISA）
Protocol:
1、准备样品：样品来源可以是细胞裂解物或是血液中包含的抗体，用PBS进行梯度稀释。
2、将稀释好的样品加入96孔板，4℃过夜孵育，进行抗原吸附。
3、孵育后，用PBST清洗孔内没有结合或结合力弱的抗原。
4、用封闭液覆盖没有结合蛋白的微孔表面，37℃孵育2h。避免一抗的非特异性结合。
5、封闭液封闭后，用PBST清洗3次后，加入稀释好的一抗（高特异性），37℃孵育1h。抗体可按倍数稀释，且每孔做两个或三个副孔。
6、一抗孵育后，用PBST清洗3次后，加入稀释好的连接酶的二抗，37℃孵育1h。
7、二抗孵育完后，用PBST清洗3次，加入底物，避光孵育30min，用酶标仪检测OD值。OD值越高，样品中目的蛋白的含量越高。
夹心法（Sandwich ELISA）
Protocol：
1、准备样品：样品来源可以是细胞裂解物或是血液中包含的抗体，用PBS进行梯度稀释。
2、孵育一抗，4℃过夜，将一抗吸附在板底表面。
3、孵育后，用PBST清洗孔内没有结合或结合力弱的抗体。
4、用封闭液覆盖没有结合蛋白的微孔表面，避免抗原的非特异性结合。
5、封闭液封闭后，用PBST清洗3次后，加入样品（抗原），37℃孵育1h。抗体可按倍数稀释，且每孔做两个或三个副孔。
6、用PBST清洗3次后，加入检测抗体，37孵育1h。
7、用PBST清洗3次后，加入酶连抗体，37℃孵育1h。
8、用PBST清洗3次，加入底物，避光孵育30min，用酶标仪检测OD值。OD值越高，样品中目的蛋白含量越高。
竞争性ELISA（competitive ELISA）
Protocol:
1、将抗体和抗原在试管里结合形成复合物。
2、将复合物加入96孔板中，4℃过夜孵育，使其吸附在孔底表面。
3、用PBST洗3次，将没有吸附的蛋白或复合物洗掉。
4、用封闭液覆盖没有结合蛋白的微孔表面，37℃孵育1h。避免二抗的非特异性结合。
5、用PBST洗3次，加入竞争性酶联抗体（可与抗原样品竞争结合一抗），37℃孵育1h。
6、用PBST洗3次，加入底物，避光孵育30min，用酶标仪检测OD值。OD值越小，说明样品中目的蛋白的含量越高。
当然，上述实验还不足以完全扫除临床科研者攀登科研高峰的绊脚石。
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拥有了这本书，不仅相当于有了一本protocol，更相当于有一位在实验室里身经百战的师兄随时相伴左右，因为书中所有的实验技术作者都亲自实践过，实验中潜藏暗伏的陷阱作者都经历过，并也已经找到了相应解决方法，让实验新人少走弯路。
在书中，小到RNA抽提和定量分析，大到共聚焦显微镜的操作和流式操作，包括实验动物的抓握、灌胃、静脉注射等，其原理和操作步骤都得到了详细的阐述。
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重要的是，关于实验流程的描述，还配有中英文对照，绝对是撰写SCI方法部分的最佳参考，是英语战五渣的绝对福音！
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