基因敲除技术的主要方法和步骤有哪些？

基因敲除是用含有一定已知序列的DNA片段与受体细胞基因组中序列相同或相近的基因发生同源重组，整合至受体细胞基因组中并得到表达的一种外源DNA导入技术。它是针对某个序列已知但功能未知的序列，改变生物遗传基因，令特定的基因功能丧失，从而使部分功能被屏蔽，并可进一步对生物体造成影响，进而推测出该基因的生物学功能。目前能实现基因敲除的方法有：

1.运用基因同源重组进行基因敲除

(1)步骤方法

A 构建基因载体：把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA 分子都重组到带有标记基因的载体上，使之成为重组载体，常用的标记基因有：neo 基因、TK 基因等。根据实验目的不同，打靶载体分为全基因敲除、条件敲除、基因敲进、诱导性基因敲除等打靶载体。

B获得胚胎干细胞：现在基因敲除一般采用是胚胎干细胞，最常用的是鼠，而兔、猪、鸡等的胚胎干细胞也有使用。基因敲除一般应用于鼠，常用的鼠的种系是129及其杂合体，因为这类小鼠具有自发突变形成畸胎瘤和畸胎肉瘤的倾向，是基因敲除的理想实验动物。有些科研机构和单位已经运用C57BL/6遗传背景的小鼠的胚胎干细胞进行基因打靶，广泛运用于免疫学、神经学、癌症等领域。

C同源重组：将重组载体通过一定的方式(电穿孔法或显微注射)导入同源的胚胎干细胞(ES cell)中，使外源DNA 与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重组，将重组载体中的DNA 序列整合到内源基因组中，从而得以表达。一般来说，显微注射命中率较高，但技术难度较大，电穿孔命中率比显微注射低，但操作便利。

D筛选已表达的细胞：由于基因转移的同源重组自然发生率极低，因此要从众多细胞中筛出真正发生了同源重组的胚胎干细胞。目前常用的方法有：正负筛选法(PNS法)、标记基因的特异位点表达法以及PCR 法，其中应用最多的是PNS法。

E 性状观察：通过观察重组小鼠的生物学形状的变化进而了解目的基因变化前后对小鼠的生物学形状的改变，达到研究目的基因的目的。

F 得到纯合体：由于同源重组常常发生在一对染色体上中一条染色体中，所以如果要得到稳定遗传的纯合体基因敲除模型，需要进行至少两代遗传。

(2)条件性基因敲除法

条件性基因敲除法可定义为将某个基因的修饰限制于小鼠某些特定类型的细胞或发育的某一特定阶段的一种特殊的基因敲除方法。它实际上是在常规的基因敲除的基础上，利用重组酶Cre介导的位点特异性重组技术，在对小鼠基因修饰的时空范围上设置一个可调控的“按钮”，从而使对小鼠基因组的修饰的范围和时间处于一种可控状态。

①  条件性基因敲除法的原理

条件性基因敲除主要通过Cre/loxP或者Ftp/FRT重组系统来实现的。这两个系统都是位点特异性重组酶系统已发展成为在体内、体外进行遗传操作的有力工具。这两个系统的应用，可以使靶基因的表达或缺失发生在试验动物发育的某一阶段或某一特定的组织器官。

(3)诱导性基因敲除法

某些启动子如诱导型启动子也可以受某些外源性化学物质的调控，外源性调控的基因敲除可以避免在胚胎发育早期由于基因功能的异常所产生的副作用。

几种常见的诱导性类型如下：四环素诱导型、干扰素诱导型、激素诱导型、腺病毒介导型。

诱导性基因敲除拥有一些自身优越性：时间易控制、避免基因突变的致死性、重组效率高等。

2 插入突变进行基因敲除

(1)原理

该方法利用某些能随机插入基因序列的病毒、细菌或其他基因载体，在目的细胞基因组中进行随机插入突变，建立一个携带随机插入突变的细胞库，然后通过相应的标记进行筛选获得相应的基因敲除细胞。根据细胞的不同，插入载体的选择也不同。动植物细胞可用逆转录病毒；农杆菌介导的T-DNA转化和转座子常用于植物细胞；细菌基因敲除可用噬菌体。

(2)条件性基因敲除法

最近发展起来的新型方法——基因捕获法，也是利用随机插入突变进行基因敲除的。通常基因捕获载体还包括一个无启动子的基因，将该基因插入到胚胎干细胞染色体组中，并利用捕获基因的转录调控元件实现表达，克隆的ES可以很容易地在含G418 的选择培养基中筛选出来，从理论上讲，在选择培养基中存活的克隆应该100%地含有中靶基因，中靶基因的信息可以通过筛选标记基因侧翼cDNA或染色体组序列分析来获得。

3.RNA干扰引起的基因敲除

由于少量的双链RNA就能阻断基因的表达，并且这种效应可以传递到子代细胞中,所以RNA干扰的反应过程也可以用于基因敲除。近年来，越来越多的基因敲除采用了RNA干扰这种更为简单方便的方法

(1)原理

RNA干扰是一种普遍的转录后基因沉默机制，由siRNA引起的。siRNA是外源基因产生的一段长度为21-22nt的一系列片段的总称，具有很强的关闭基因的功能，能够介导RNA干涉现象，诱导出一种自由siRNA-核酸酶-螺旋酶等结合在一起的诱导沉默复合物。该复合物可以解开siRNA并精准地指导特异性mRNA降解，使细胞抵抗外来基因侵入及病毒感染。因此，将通过dsRNA分子导入细胞内，特异性地降解细胞内与其同源的mRNA，封闭内源性基因的表达来失活该基因实现基因敲除。

4.CRISPR/Cas9基因敲除

CRISPR是一种由RNA指导Cas核酸酶对靶向基因进行特异性DNA修饰的技术。此系统的工作原理是通过人工优化的具有指导作用的单链gRNA引导核酸Cas蛋白在gRNA配对的靶位点出剪切双链DNA，引起DNA双链断裂，进而利用生物体内非同源末端修复机制或同源重组机制修复DNA，导致基因移码突变、替换或删除，导致基因功能丧失。该技术可广泛用于植物、哺乳动物、鸟类以及微生物中。

其实，除上述几种普遍使用的基因敲除方法外，还有一些基于其他原理的敲除技术正处于研究和不断完善过程中。随着其他学科的不断发展，新的基因敲除原理也会被不断发掘出来，运用到实际操作中。

参考文献：

[1]李今煜，陈建铭等. 几种常用的基因敲除技术[J]. 武夷科学，2001，23（1）：187-189

[2]王又红. 基因敲除技术的应用现状与发展前景[J].国外医学杂志，1999，26-5