压力异常和基线噪声，液相色谱这两大故障排查有办法了！

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液相色谱仪已经成为实验室一款常用仪器，使用仪器时最常见的故障就是遇到漏液和堵塞情况。上述两个问题在数值上通常都表现为压力的变化：漏液会引起系统压力的降低，而堵塞会引起系统压力的飙升。

而在液相色谱中另一个比较让人头疼的问题是基线噪音干扰，小编以这两个问题为例给大家分享下液相色谱故障的排查。

一、液相色谱压力异常

液相系统压力产生的原因在于流动相流经管路及色谱柱时会有阻力，即所谓的反压或系统压力。

漏液会引起系统压力的降低，而堵塞会引起系统压力的飙升。

系统压力的单位有：巴(Bar)、兆帕(Mpa)和磅/平方英寸(psi)，它们之间的换算关系为1 Bar=0.1 Mpa=14.5 Psi。

1. 影响因素

影响系统压力的因素主要有流动相的溶剂组成、温度及流速这三方面：

（1）流动相的粘度是产生反压的主要原因，下图为有机溶剂－水的粘度随组成与压力的关系图：

由上图可以看到，乙腈-水比例为（20：80）、甲醇-水比例为（40：60至50：50）时，系统的压力最大。因此，在做实验时应尽量避开这个比例范围。另外，异丙醇粘度大，一般不作流动相使用。

（2）流速对反压的影响是线性关系，流速增加，反压亦增大。

（3）温度对反压的影响是反比关系，温度升高，反压降低，对某些流动相的影响更大一些。

（4）液相色谱仪各模块之间的连接管路也会产生压力，系统压力与管路的长度成正比，与管路直径的四次方成反比（1/D4）。上述考虑的是柱外因素对系统压力的影响，色谱柱对系统压力的影响也很大，反压与色谱柱长度成正比，与填料颗粒度的平方成反比（2.5μm填料比3.5μm填料反压高）。

2. 压力原因

具体到压力问题的表现形式上，主要有压力高、压力低或没有压力以及压力不稳：

（1）造成压力高问题的主要原因有：

①温度太低；

②流速太高；

③流动相粘度大；

④管路堵塞；

⑤仪器或色谱柱堵塞；

⑥压力传感器问题。

系统压力高的故障排除流程图如下：

（可点击图片放大查看）

（2）产生压力低情况的可能原因：

①系统内有渗漏处；

②单向阀堵塞；

③入口管路有气泡；

④溶剂滤头堵塞；

⑤所用溶剂不正确，储液瓶中无溶剂；

⑥温度太高，流速太低；

⑦泵未输送流动相；

⑧泵关闭或保险丝断了。

以上为仪器单向阀的结构示意图，如果某些原因造成宝石球与球基座发生黏结，造成液体不能进入到泵中，从而造成泵的压力偏低。

3. 造成压力波动可能的原因有：

（1）脱气机排气不充分；

（2）流动相未正确脱气；

（3）所用溶剂不混溶或易挥发；

（4）压力传感器及泵问题。

其中，大多数的压力波动都是由于气泡引起的（如下图）：

二、基线噪音问题

1.基线噪音大

（1）流动相中有气体—溶剂脱气；

（2）流动池中有气泡—在出口处使用0.009的管路；

（3）色谱柱上的污染物被洗脱-平衡系统，直至基线稳定；如样品中有保留非常强的组分，可设置强洗脱程序；

（4）渗漏-此时应修复渗漏，重新连接或更换接头；

（5）检测器灯能量低-更换灯；

（6）灵敏度太高—使用合适的采样频率，调节增益（如ELSD检测器）；

（7）检测器流动池脏—清洁流动池；

（8） 电噪音-除去电噪音的来源：屏蔽电缆，清洁触点；

（9）采样频率设置过大—味追求高采样频率，可能对灵敏度没有任何帮助，同时也会产生比较大的噪音：UV检测器推荐降低采样频率，HPLC推荐1-5HZ，UPLC推荐20HZ。

2.同步的基线噪音

（1）大多数情况下都是泵引起的，泵头中存在空气—将溶剂脱气，并重新灌注泵；

（2）单向阀问题—超声清洗单向阀或更换；

（3）柱塞杆断裂—更换；

（4）混合问题—更换一个体积更大的Mixer，以增加系统体积；

（5）电噪音—改变电路，除去来源。

3.不同步的基线噪音

（1）气泡—流动相要脱气；

（2）检测器中有气泡/空气—流动相脱气，或在检测器的后面加反压（不适用于RI检测器） ；

（3）渗漏—特别是肉眼无法发现的微漏或者泵的内漏，会造成流速的变化和混合比例的变化，从而导致基线噪音，此时应修复渗漏，重新连接或更换接头；

（4）管路堵塞—除去堵塞，冲洗系统；

（5）电噪音—除去来源，改变电路。

4.基线漂移：上漂或者下漂

（1）梯度变化引起，如溶剂B的吸收值高于溶剂A—使用基线差减，或尝试新的流动相；

（2）化合物从色谱柱上洗脱—平衡系统，直至基线稳定；如样品中有保留非常强的组分，可设置强洗脱程序；

（3）溶剂改变（气体吸附，蒸发）—氦气脱气，隔离溶剂；

（4）溶剂渗漏—拧紧或者更换接头；

（5）检测器温度影响（尤其是示差，电化学以及电导检测器）—流动池温度调节；

（6）柱温波动—等待柱温平稳，使用柱预加热器；

（7）压力变化—过滤溶剂以及样品，或样品太粘稠；

（8）混合问题—更换一个体积更大的Mixer，以增加系统体积。

5.Cyclic基线

（1）温度影响—隔离热源，或搬离临近的通风口，或增加流动池温度；

（2）混合问题—更换一个体积更大的Mixer，以增加系统体积；

（3）流动相中的气体—溶剂脱气；

（4）泵不稳定—检查维修泵；

（5）管路堵塞—冲洗系统，排除并除去堵塞源头；

（6）电问题—改变电路，或除去根源。

6.基线上的毛刺

（1）气泡—溶剂脱气，并重新灌注泵，流动相脱气越好，基线就会越好；

（2）信号连接不好，连线变松—清洁并拧紧检测器上的导线，或检查连线是否有损坏，或更换铲形接线片；

（3）灯继电器试图点燃熄灭的灯—更换灯；

（4）电噪音—更换电路，或除去根源。

7.小结

（1）确保无电源及电噪音干扰；

（2）为避免基线噪音，确保仪器系统内无气泡或空气，流动相首选过滤脱气；排尽管路、进样器、检测池中的气泡；选择合适的接头和管路，防止渗漏；

（3）在编辑方法时，针对HPLC和UPLC仪器UV检测器设置合适的采样频率，HPLC推荐1-5HZ，UPLC推荐20HZ；

（4）保持良好的操作习惯，如UPLC仪器水相流动相每天更换，添加了缓冲盐的流动相过0.2μm溶剂过滤膜等，都会减小基线噪音的产生。

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