深刻剖析免疫治疗预测指标TMB
随着免疫治疗在实体肿瘤以及恶性血液肿瘤中传来的佳绩，说其火到“飞入寻常百姓家”的程度也不为过，但是目前差不多只有20%-40%的肿瘤患者对免疫治疗是可以获益的，盲目的尝试免疫治疗新药，不仅耽误病情的治疗，让患者承受额外的副作用，同时也给家庭增加一定的负担，所以筛选出适合免疫治疗的患者，迫在眉睫。目前被FDA批准的用来评估免疫治疗疗效的biomarker是PD-L1，但是随着临床试验的开展，我们也发现PD-L1只是一个相对而非绝对的预测免疫治疗的标志物，今天小编就带大家全面深刻的认识下TMB这个预测指标。究竟什么是TMB？它为什么可以预测免疫治疗的疗效？目前有哪些临床试验凭借TMB筛选出获益人群？这个指标和PD-L1，MSI-H/dMMR有什么区别？最后如何检测这个指标？
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什么是TMB？
TMB（tumor mutational burden）即肿瘤突变负荷，指的是一份肿瘤样本中，所评估基因的外显子编码区每兆碱基中发生置换和插入/缺失（非同义突变）突变的总数。所以理解TMB，首先需要知道两个重要概念germline mutation（种系突变或胚系突变）和somatic mutation（体细胞突变），而TMB针对的突变是somatic mutation体细胞突变。它可能受到外源性诱变因素的影响，比如肺癌中烟草（吸烟）诱导的C→A的突变。恶性黑色素瘤中，紫外线照射引起的C→T的突变，以及内源性因素的影响引起的突变可以是DNA错配修复突变，比如结直肠癌和食管癌中的MSI（微卫星不稳定）。体细胞突变一旦发生，可表现在RNA和蛋白水平，产生的新抗原（或新表位）、蛋白片段、肽段等被自身免疫系统识别为非自我（non-self）抗原，激活T细胞，引起免疫反应。
此外肿瘤突变包含同义突变和非同义突变，而TMB针对的是非同义突变，包括三方面，单个碱基的替换造成的非同义突变（一个核苷酸突变改变一个蛋白的氨基酸顺序），错义突变（非同义点突变，单个核苷酸改变导致一个密码子编码一个不同的氨基酸）和无义突变（非同义点突变使一个密码子变为终止密码子引起多肽链合成提前终止），其中非同义突变会改变氨基酸编码序列，导致肿瘤细胞表达正常细胞所没有的异常蛋白。这些异常的蛋白如果能被活化的T细胞所识别，就称为“新抗原（neoantigen）”，能够产生新抗原的突变即为具有免疫原性的突变。
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TMB如何预测免疫治疗的疗效？
在诱变剂（吸烟，紫外线照射等）的影响下，细胞可发生体细胞突变（somatic mutation），这些突变可影响转录，导致mRNA的改变，进而会产生新的蛋白质或多肽。这些新的蛋白质或多肽可被自身免疫系统识别为非自我（non-self）抗原，即突变相关新抗原（mutation-associatedneoantigen），从而激活T细胞，引起免疫反应。肿瘤细胞基因组中累积的突变数目越多，产生的突变相关新抗原（肿瘤免疫的靶点）也越多，从而可以激活更多的T细胞，产生更强大的免疫反应。因此TMB越高，肿瘤就越有可能对免疫治疗有效。下图简要阐述了从体细胞突变到激活免疫攻击的6个步骤。
1.体细胞突变→2.转录成突变的mRNA→3. 蛋白酶加工突变蛋白→4.TAP介导的肽段转运进入内质网腔→5.与MHC I类复合物结合→6. T细胞识别细胞表面新抗原。
需要说明的一点是，在强调TMB对免疫治疗指导作用的同时，并不能忽略肿瘤驱动基因（如EGFR、ALK、ROS1等）突变在肿瘤靶向治疗中的指导作用。通常，TMB主要用于驱动基因野生型患者免疫治疗的指导，而肿瘤驱动基因突变型患者依然要用靶向药物来治疗。
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TMB预测免疫治疗疗效的经典临床试验
Checkmate026研究：nivo与化疗对比一线治疗非小细胞肺癌患者。
AACR2017大会报告的CheckMate 026三期临床试验的回顾性研究，结果显示，相比PD-L1，选择TMB作为Opdivo治疗NSCLC的biomarker，能更好地区分获益人群。该研究发现，在TMB高表达的病人中，采用Opdivo进行治疗后，ORR（客观缓解率47% vs. 28%）和PFS（无进展生存期，9.7月vs. 5.8月）结果显著优于化疗。
Checkmate032研究：nivo±ipi治疗复发的高TMB小细胞肺癌患者显高疗效
2017年世界肺癌大会上，报道了CheckMate-032的临床试验结果。这是一项纳入了401名一线治疗失败的晚期肺癌患者的II期临床试验，接受PD-1抑制剂单独或联合伊匹木单抗治疗。按照TMB高低划分成TMB高、TMB中、TMB低三类病人。
接受nivo+ipi联合治疗的TMB高低中三组有效率分别为：46%、22%、16%，TMB高的人群有效率比其他两组高2倍以上！
接受nivo单药治疗的TMB高低中三组有效率分别为：21%、7%、5%， TMB高的人群有效率比替他两组的ORR高3倍！
接受nivo+ipi联合治疗的TMB高低中三组1年OS率分别为：62.4%、23.4%、19.6%.；接受nivo单药治疗的TMB高低中三组1年OS率分别为：35.2%、26.0%、22.1%。
Checkmate227研究： nivo＋ipi与化疗对比一线治疗晚期非小细胞肺癌患者，高TMB患者组，免疫联合组PFS较化疗组明显升高。
2018 AACR报道的checkmate227研究, 针对高TMB组别患者进行分析，结果发现，高TMB人群中nivolumab联合ipilimumab治疗对比化疗组的PFS显著获益。1年PFS增加将近3倍（43% vs 13%，HR=0.58，P=0.0002），降低42%疾病进展风险，高TMB人群联合治疗组的ORR较化疗组提高将近2倍（45.3% vs 26.9%）。高TMB患者初步1年OS数据显示联合治疗组优于化疗组（67%vs 58%，mOS：23月 vs 16.4月）。
POPLAR+BIRCH/ FIR研究：atezolizumab治疗晚期NSCLC患者，TMB具有免疫疗效预测作用。
除了Opdivo，罗氏的PD-L1单抗Atezolizumab在筛选更易获益的患者时，也开展TMB与免疫治疗疗效的研究分析。更妙的是，不仅研究TMB表达高低在免疫治疗中的差异，同时还研究TMB表达高低在化疗组中的疗效差异。结果发现在免疫治疗中，TMB表达高的患者更易获益，无论是PFS还是OS，都显著优于TMB低的患者。而在化疗组，TMB的表达高低与PFS和OS无直接相关关系。也从另外一个侧面，说明TMB是免疫治疗疗效的预测biomarker,不是化疗疗效预测的biomarker！
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TMB与PD-L1以及MSI-H的关系？
2018年，MSK对240例接受PD-1抑制剂治疗的晚期肺癌患者的相关资料进行总结和分析时，发现PD-L1表达高低和TMB高低无关。PD-L1表达量低的，TMB不一定低；TMB低的，可能PD-L1表达是高的。PD-L1表达量和TMB同时都高的患者，疗效最好，临床获益率为50%；两者都低的患者，使用PD-1抑制剂，临床获益率只有18.2%。TMB与PD-L1表达是两个独立的生物标志物。TMB+PD-L1表达两个标志物进行联合预测，能够提高整体的预测效能：如PD-L1阳性且高于mTMB的患者的ORR高达66%，mPFS则近两年，显著性地高于另三组，并具有统计学差异。
MSI可以理解为TMB的一种子集，一个分部。因为绝大多数MSI不稳定的病人，TMB都是高的；但是TMB高的病人，并不一定都是MSI不稳定的，还有相当一部分病人是MSI稳定型的。
简单地说，TMB更全面，PD-L1、MSI可以认为是其中的子集。也就是说，PD-L1低表达或MSI-L，原本使用PD-1免疫治疗的效果不被看好，但患者有可能TMB高表达，那么患者也有可能从PD-1免疫治疗中获益。大型研究也初步探索了其中的原因，发现：DNA错配修复相关基因，比如MSH2/MSH6/ MLH1/PMS2/POLE等，如果发生了变异，就有可能导致TMB高；此外，PMS2基因启动子区突变，也是TMB高的一个很重要的原因。而且PMS2基因启动子区突变，是该项研究的新发现，以前都没有意识到，这种变异在诸多肿瘤中存在。
那么是不是说TMB就是一个完美的biomarker?加利福尼亚圣地亚哥摩尔癌症中心，使用NGS测1638名癌症病人石蜡组织样本，TMB水平分为三组：低TMB（1-5个突变/Mb）、中TMB（6-19个突变/Mb）、高TMB（≥20个突变/Mb）。其中151名患者接受免疫治疗，其中多数病人是黑色素瘤和非小细胞肺癌。
如上图所示，对免疫治疗应答或不应答，都有高TMB的病人，也都有低TMB的病人，从平均情况来看虽然高TMB的病人治疗应答较好，而且对免疫治疗应答的病人其TMB平均值也高于非应答病人，但对于低TMB的病人，不能完全排除使用免疫治疗有效的可能性。
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如何检测TMB？
现在行业内公认的TMB检测金标准就是WES测序（全外显子组测序技术），对≥30Mb的CDS区域（蛋白质编码区，外显子）序列中的突变数量进行统计分析与计算。但是在实际临床应用中，WES的时间和经济成本确实是不容忽视的问题，所以目前有越来越多的针对CGP（Comprehensive Genomic Profiling ，全面的基因组分析）的panel出来，并且被证实这些几百个基因的panel可以达到与WES的高度相关性，其中比较有名的就是2017年底被FDA批准的两个NGS大panel产品：FoundationOne CDx（F1CDx）与 MSK-IMPACT，他们与WES的一致性分析，可以看出，采用NGS的目标基因测序panel检测TMB已成为替代WES的方法。
但是国外这两大基因检测的pannel，对于国内患者还是遥望不可及，于是很多国内的基因检测公司也开始开展自己家的基因检测pannel。今天就分析下目前市场上患者使用较多的燃石基因检测的OncoScreenTM，集合FoundationOne CDx（F1CDx）与 MSK-IMPACT Panel的共同点以及增加中国人自己的基因热点，大小为1.6Mb，包含520个基因。 分享一下患者通过使用OncoScreenTM pannel检测出来TMB，进而接受nivolumab治疗后病灶缩小的案例。
针对TMB检测最好是拿组织切片，做深度的测序分析。当然，实在没有组织切片的病友，也可以考虑拿血代替，但是目前血液标本测定TMB的准确度还不完美，可能存在偏差。至于TMB到底多高才算高？一般而言，对于同一种癌症，突变负荷居同癌种前25%已经就算不错了。
TMB作为免疫治疗预测的biomarler，在实际临床应用中还有其优点：1.可以血检，患者随时抽血即可检测，创伤性小，且及时性好；2.TMB与PDL1相互独立，因此在PDL1检测阴性的情况下依然可以再进行TMB的NGS检测来判断是否能进行免疫治疗的可能。3.目前检测TMB的panel在评估TMB的同时还可检测基因突变情况，也能提示部分靶向治疗的可能。因此TMB在免疫治疗应用中的前景非常乐观。
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