帕金森病患者肠道菌群与血清炎症因子的相关分析
童巧文 陈杨芳 林建萍 冯梅 叶华
结果 从属水平上看，HC组相对于PD组，毛螺旋菌、链球菌属、克雷伯菌属、伯劳特菌属4种属显著增加（P<0.05）。PD组相对于HC组，有埃希氏菌属、瘤胃球菌属、巨单胞菌属、阿克曼氏菌属、巨型球菌属、颤杆菌克属、伯克氏菌属、埃森博格拉属、异味杆菌属、丹毒丝菌科未命名属、脱硫弧菌属、普雷沃氏菌科、单胞菌属、脱硫弧菌科、嗜胨菌属明显增加（P<0.05）。PD组血清TNF-α水平为101.56（46.30，200.62），高于对照组血清TNF-α水平83.53（37.72， 191.27），差异有统计学意义（P<0.05）;两组血清IL-6，LPS水平，差异无统计学意义（P>0.05）。TNF-α、IL-6、LPS与脱硫化弧菌属（Desulfovibrio）有正相关（P<0.05），IL-6、LPS与丹毒丝菌科未命名属（Erysipelotrichaceae incertae sedis）有正相关（P<0.05），IL-6、LPS与伯劳特菌属（Blautia）有正相关（相关系数为P<0.05）。 结论 帕金森病组和健康对照组的菌群结构存在有差异。PD肠道菌群中条件致病菌增多，并与细胞因子有一定相关。这些改变可能与帕金森病的发病机制有关。
[关键词] 帕金森病;肠道菌群;炎症因子;相关性分析
[中图分类号] R742.5 [文獻标识码] A [文章编号] 1673-9701（2021）14-0012-04
Correlation analysis on intestinal flora and serum inflammatory factors in the patients with Parkinson′s disease
TONG Qiaowen1 CHEN Yangfang2 LIN Jianping2 FENG Mei1 YE Hua1
1.Department of Neurology， Wenzhou People′s Hospital， Wenzhou 325000， China; 2.Clinical Laboratory， Wenzhou People′s Hospital， Wenzhou 325000， China
[Abstract] Objective To analyze the correlation between changes of intestinal flora and serum inflammatory factors in the patients with Parkinson′s disease（PD）. Methods A total of 30 patients with primary PD who were admitted to the Department of Neurology in Wenzhou People′s Hospital from November 2017 to February 2019 and 30 patients undergoing routine physical examination during the same period were selected. After grouping， the general information was collected， and the blood and stool samples were collected. The types of microorganisms was determined through 16S-rRNA sequencing and the classification analysis of microorganisms was performed. The serum lipopolysaccharide （LPS）， interleukin-6 （IL-6）， tumor necrosis factor-α （TNF-α） were detected. Correlation Analysis was carried out between different flora abundance and serum inflammatory factors in PD. Results From the genus level， compared with the PD group， the HC group had significant increases in four genera： Lachnospira， Streptococcus， Klebsiella， and Blautia（P<0.05）. Compared with the HC group， the PD group had significant increases in Escherichia， Ruminococcus， Megamonas， Akkermansia， Megacoccus， Oscillibacter， Burkholderia， Erysipelotrichaceae incertae sedis， Desulfovibrio， Desulfovibrio， Desulfovibrio， and Peptoniphilus （P<0.05）. The serum TNF-α level in the PD group was 101.56 （46.30， 200.62）， which was higher than the serum TNF-α level of 83.53（37.72， 191.27） in the control group， and the difference was statistically significant（P<0.05）. There was no statistical difference in the levels of serum IL-6 and LPS between the two groups（P>0.05）. TNF-α， IL-6， and LPS were positively correlated with Desulfovibrio（P<0.05）， IL-6， LPS were positively correlated with Erysipelotrichaceae incertae sedis（P<0.05）， and IL-6 and LPS were positively correlated with Blautia （P<0.05）. Conclusion There are differences in the structure of the flora between the Parkinson′s disease group and the healthy control group. The increase in the intestinal flora of conditional pathogenic bacteria of PD is related to cytokines. These changes may be related to the pathogenesis of Parkinson′s disease.
[Key words] Parkinson′s disease （PD）; Intestinal flora; Inflammatory factors; Correlation analysis
帕金森病（Parkinson′s disease，PD）是一种中老年人常见的中枢神经系统退行性疾病。它的病理的特征在于α-突触核蛋白异常聚积，并影响脑-肠轴各级组织，包括中枢神经系统、自主神经系统和肠神经系统。最近一项涉及新诊断的PD患者的研究证实，与健康对照组相比，这些受试者的肠道通透性显著增加，这与肠黏膜中大肠杆菌的更强染色和全面暴露于血清脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）有关[1]。值得注意的是，这些改变也与肠道神经元中α-突触核蛋白的异常积聚有相关性[2]。越来越多的证据证实肠道菌群的改变先于或发生在PD过程中[3，4]。与肠道菌群的改变相关的肠道炎症可能促使α-突触核蛋白时错误折叠的发生[5，6]。
本研究通过16S-rDNA测序确定PD肠道菌群种类并进行微生物的分类分析，深入研究PD患者的肠道菌群结构的多样性特征，并应用酶联免疫法检测血清LPS，白细胞介素-6（Interleukin-6，IL-6）、肿瘤坏死因子-α（Tumor necrosis factor-α，TNF-α），以探索PD腸道菌群与炎症反应的相关性。
1 资料与方法
1.1 一般资料
研究对象及分组：本研究对象主要分为帕金森病例组（PD组）与健康对照组（HC组）。来自2017年11月至2019年2月在温州市人民医院门诊和住院诊治原发性PD的患者30例。PD组中男女比例为14∶16，平均年龄（66.5±7.4）岁。同时选择温州市人民医院体检中心30例年龄、性别匹配的健康志愿者作为健康对照组（HC组）。其中对照组中的男女比为18∶12，平均年龄（65.1±5.9）岁。研究获得温州市人民医院医学伦理委员会的批准。所有受试者签署了试验知情同意书。
PD组入组标准：符合英国脑库帕金森病诊断标准[7]，并由经验丰富的神经专科医师确诊。PD组排除标准：①严重肝肾功能不全、恶性肿瘤、急性心力衰竭等严重基础疾病者;②胃肠手术病史;③严重消化道疾病史;④3个月内服用过抗生素和益生菌。HC组入组标准：选择与病例组年龄、性别相匹配的健康体检者作为对照组。3个月内未服用过抗生素和益生菌。
一般资料的收集：所有入组受试者均完善性别、年龄、身高、体重等人口学资料;所有PD患者收集病程、帕金森药物服用情况等病史资料并使用Hoehn & Yahr（H-Y）分级和统一帕金森病评定量表第Ⅲ部分[8]（Unified Parkinson′s disease rating scale，UPDRS第Ⅲ部分）进行评估。受试者一般临床资料见表1。
1.2 研究方法
1.2.1 16S rRNA高通量测序 所有受试者采集粪便标本后，将标本储存在微生物检测试剂盒（G-BIO Biotech，Inc.，Hangzhou，China）中。使用北京天根生化科技有限公司的粪便基因组DNA试剂盒（DP328），对样本进行DNA提取。使用特定设计的细菌PCR扩增引物对粪便样本中的16S rRNA进行PCR扩增，具体引物序列如下：正向引物：5-tcgtcggcagcgtcagatgtgtataagagacagCCTACGGGNGGCWGCAG-3，反向引物：5-gtctcgtgggctcggagatgtgtataagagacagGACTACHVGGG TATCTAATCC-3。对扩增PCR产物进行2%琼脂糖电泳分析。利用Illumina Miseq PE300测序平台进行测序。
1.2.2 血清炎症因子检测 所有受试者均于上午采集肘静脉血样，将样本置于型号EDTA抗凝管中，室温静置2 h，离心机离心时的参数按统一标准设定，离心温度4℃，离心机离心速度为1000 g/min，离心时间为15 min。标本离心后使用一次性无菌移液管将上层血清移至无酶EP管中，-80℃冰箱中进行保存，待收集完所有受试者的血清后进行细胞因子的检测。采用夹心法酶联免疫吸附测定试剂盒（Enzyme Linked-Immuno-Sorbent Assay，ELISA）测定血清LPS、IL-6、TNF-α的水平，采用博士德生物试剂盒进行检测。
1.3统计学分析
统计数据使用R（v3.6.1）语言软件进行分析。在Rstudio界面，对于正态分布计量资料，用均数±标准差（x±s）表示，比较两独立样本间均数采用t检验，非正态分布计量资料，用中位数（最小值，最大值）表示，比较两个独立样本的分布采用秩和检验。两个样本率的比较用Pearson χ2检验，若T<5时，采用Fisher确切概率法。使用Spearman相关系数分析PD肠道菌群丰度与临床症状之间的相关性。根据数据特点制成相应图形和表格。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 两组一般临床资料比较
两组间在性别、年龄、体质量指数等一般临床资料方面，差异无统计学意义（P>0.05）。在血清炎症因子方面，PD组TNF-α水平高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。
2.2 测序数据多样性分析
测序数据Alpha 指数多样性分析结果见表1。从OTU数、Chao1指数、shannon指数和simpson指数来看，PD组与HC组肠道菌群分布无明显差异。
2.3 帕金森组和对照组的属水平物种差异
将项目中的每个菌的丰度在HC组和PD两组之间进行比较，将相对丰度大于1%的菌属进行统计，将有明显差异的菌保留。HC组相对于PD组，有4种genus在HC组明显增加，从高到低分别是毛螺旋菌属（Lachnospiraceae）、链球菌属（Streptococcus）、克雷伯氏菌属（Klebsiella）、伯劳特菌属（Blautia）。PD组相对于HC组，PD组有15种属明显增加，从高到低分别是埃希氏菌属（Escherichia/Shigella）、瘤胃球菌属（Ruminococcaceae）、巨单胞菌属（Megamonas）、阿克曼氏菌属（Akkermansi）、巨型球菌属（Megasphaera）、颤杆菌属（Oscillibacter）、伯克氏菌属（Burkholderiales）、埃森博格拉属（Eisenbergiella）、异味杆菌属（Odoribacter）、丹毒丝菌科未命名属（Erysipelotrichaceae_incertae_ sedis）、脱硫弧菌属（Desulfovibrio）、普雷沃氏菌属（Prevotellaceae）、单胞菌属（Porphyromonas）、脱硫弧菌科（f_Desulfovibrionaceae）、嗜胨菌属（Peptoniphilus）。
2.4 菌群与细胞因子之间的关系
PD组中与HC组间比较存在的差异菌属分别与PD血清指标进行相关分析。TNF-α、IL-6、LPS與脱硫化弧菌（Desulfovibrio）有正相关（相关系数分别为0.477、0.641、0.641，P值分别=0.025、0.003、0.022），IL-6、LPS与丹毒丝菌科未命名属（Erysipelotrichaceae incertae sedis）有正相关（相关系数为0.761、0.761，P=0.000、0.024），IL-6、LPS与伯劳特氏菌属（Blautia）具有不同程度的正相关性（相关系数为0.603、0.603，P=0.006、0.004）。从结果上来说，IL-6和LPS更为同步。
3 讨论
脑-肠轴是CNS和胃肠道之间的双向通信系统。最近研究提出肠道菌群可能影响胃肠-脑相互作用[9-12]。PD中神经元死亡的原因仍然存在争议，然而，大量证据表明炎症机制可能发挥重要作用。例如，在大脑中，小胶质细胞激活与多巴胺能神经元丢失有关，这表明神经炎症可能促进了神经退行性过程[5，12]。PD患者结肠活检显示出了炎症反应和肠胶质细胞（Enteric glial cells，EGCs）失调的证据[3，13，14]。无论在小鼠PD模型和PD患者中均发现了炎性变化与结肠渗透性增加[1，15]。以上结果均显示了肠道菌群可能通过致病细菌的LPS，导致促炎细胞因子的合成上调，促进了肠道局部和全身炎症。
测序数据的分析结果发现帕金森组肠道菌群和健康对照组在菌群丰度和菌群多样性上无统计学差异。从属水平上看，本研究发现PD组毛螺旋菌属（Lachnospiraceae）、伯劳特氏菌属（Blautia）的丰度减少，毛螺旋菌属（Lachnospiraceae），伯劳特氏菌属（Blautia）可产生丁酸盐，丁酸盐作为肠黏膜上皮的优质能量来源，可以抑制组蛋白脱乙酰酶（Histone deacetylase，HDAC）和抑制转录因子NF-κB的活性，从而减少肠粘膜炎症，发挥调节抗炎细胞因子的作用[16]。因此，PD患者的粪便中产短链脂肪酸（short chain fatty acid， SCFA）的细菌的低丰度可能是导致PD早期肠道黏膜渗透性改变的一种机制[17]。
结果还显示PD组肠道中的埃希菌属（Escherichia）和阿克曼氏菌属（Akkermansia）丰度明显升高，与既往报道的研究结果一致[18，19]。Forsyth等[1]研究发现早期诊断的帕金森病人肠道通透性增高，并与肠黏膜的大肠杆菌，肠道α-突触核蛋白的免疫组化染色以及血清脂多糖结合蛋白（Lipopolysaccharide binding protein，LBP）水平的相关。而阿克曼氏菌（Akkermansia）被认为可以降解肠道黏液层[1]。Dodiya 发现约束应激导致了口服鱼腾酮的PD大鼠模型粪便中阿克曼氏菌（Akkermansia）（粘蛋白降解的革兰阴性细菌）的相对丰度增加和内毒素血症，同时造成了肠道渗透性和氧化应激反应增加[20]。以上结果确实提供了一个假设：即肠道过度通透或PD肠道菌群失调引起的肠源性炎症促进与PD发病机制相关的神经炎症和神经退行性变化。
从细胞因子相关性结果看，TNF-α、IL-6、LPS与脱硫化弧菌（Desulfovibrio）具有正相关性。IL-6、LPS与丹毒丝菌科未命名属（Erysipelotrichaceae_incertae_ sedis）和伯劳特氏菌（Blautia）具有不同程度的正相关性。LPS、TNF-α、IL-6均参与炎症过程，与菌群的相关性结果同步，说明脱硫化弧菌（Desulfovibrio）、丹毒丝菌科未命名菌（Erysipelotrichaceae_incertae_sedis）和伯劳特氏菌（Blautia）可能通过促进肠道炎症反应而参与到PD的发病机制。
本研究结果显示，帕金森症患者产生SCFA的肠道菌群减少，而产生内毒素的菌群增多，这可能在肠道内引起慢性炎症反应和氧化应激，从而对帕金森病理生理的发展起到一定的作用。进一步开展PD肠道菌群的研究，对肠道微生物群改变与PD发病机制之间的相关性具有重要意义，且促进了以肠道菌群为治疗靶点的治疗方法研究。
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（收稿日期：2020-11-16）