细菌内毒素的概念及去除内毒素在质粒抽提中的意义

引子

内毒素在大家做质粒抽提时常接触的一个概念，其在免疫学更常以LPS的概念出现，但内毒素究竟是什么？为什么在质粒抽提的时候强调需要去内毒素？它对于我们这些并不从事免疫方面研究的科研人员又有什么需要了解的呢？遍寻网上，终发现核酸研究巨头——QIAGEN公司，已经就这些疑问做了非常好的总结，下面将相关网页的内容呈现给大家。

内毒素的概念

内毒性也称为脂多糖或LPS，是革兰氏阴性（如大肠杆菌，E.coli）胞膜上一种成分。细菌外膜的外部脂质成分完全由内毒素分子组成。一个E.coli包含约2百万个LPS分子，每个LPS分子又由疏水性的脂质A、复杂的多糖链以及带负电荷的磷酸基团组成。因此每个内毒素既包含疏水区域也包含了亲水和带电区域，从而赋予其与其它分子相互作用的独特性质。细菌在其活跃生长时表面的内毒素成分较少，而一旦其死亡则会释放大量内毒素。在质粒提取的裂解过程中，内毒素会从细菌的外膜释放到裂解液中。

内毒素污染广泛存在于多种不同形式的质粒提取方法

内毒素分子的化学结构、特性及其倾向于形成微团结构的特点，使其常与质粒DNA共存从而被共同纯化出来。

• 以CsCl超速离心纯化为例，内毒素分子度与质粒-EB复合体在CsCl中的密度几乎相当，因此纯化得到的DNA中内毒素污染依然存在。
• 同样的，在基于分子大小的层析树脂纯化法也难以区分内毒性分子形成的大体积微团与大分子DNA。
• 再者，阴离子交换树脂纯化法中，由于内毒素分子携带的负电荷也会与交换树脂相互作用，因此内毒素和DNA也会被一同纯化出来。

但是质粒中内毒素污染的程度与纯化的方法很有关系。QIAGEN质粒提取试剂盒与2次CsCl梯度离心法均可得到低内毒素的高纯度DNA。而硅胶柱法纯化的DNA内毒素污染要严重的多。而使用EndoFree Plasmid Kits提取的DNA中内毒素的含量几乎可以忽略（<0.1 EU/µg）。

内毒素如何测定?

历史上，内毒素测定主要是基于内毒素与鲎（一种海洋节支动物，也称马蹄型蟹）血液中的变形细胞冻融后的溶解物（鲎试剂）接触时可发生凝血反应。鲎试剂与细菌内毒素产生凝胶反应的机理是：鲎的血液及淋巴液中有一种有核的变形细胞，胞浆内有大量的致密颗粒，内含凝固酶及凝固蛋白原。当内毒素与鲎变形细胞冻融后的溶解物（鲎试剂）接触时，可激活凝固酶原，继而使可溶性的凝固蛋白原变成凝固蛋白而使鲎变形细胞冻融物呈凝胶状态。现在已经发展出更加灵敏的光度计测试方法，该方法主要基于鲎试剂以及一种人工合成的可产生颜色反应的底物。

LPS污染通常用内毒素单位（Endotoxin Units, EU）表示，通常情况下，1ng LPS对应于1到10个EU。

内毒素对于下游生物应用的影响

内毒素会对原代细胞的DNA转染产生严重影响，同样也会影响对培养细胞的敏感性，内毒素水平增加可导致转染效率的大幅下降。进而，使用无内毒素的质粒DNA对于基因治疗方面的应用尤为重要，因为内毒素会导致发热、内毒素休克并会在动物和人体中激活补丁级联反应。内毒素也会对体外转染免疫细胞如巨噬细胞和B细胞造成干扰，因为其可非特异性的诱发免疫反应。反应包括合成免疫递质如IL-1和前列腺素。为了防止对实验结果造成误判，实验中务必使用无内毒素污染的塑料制品、培养基、血清以及质粒DNA。

内毒素的去除

QIAGEN采用了拥有专利的无内毒素质粒操作方法，该方法在QIAGEN标准的质粒纯化方法的基础上增加了去除内毒素的步骤。中和后的细菌裂解液经QIAfilter Cartridge过滤后与特殊的去内毒素缓冲液（Buffer ER）共同冰浴。去内毒素缓冲液可以防止LPS分子结合到QIAGEN-tips中的树脂上，从而保证最终纯化的DNA每微克中含有的内毒素小于0.1EU。

使用无内毒素的塑料和玻璃制品

为了防止质粒中内毒素在初次去除以后会被再次污染，我们推荐只使用经认证无热源或无内毒素的全新塑料制品。目前已有多个厂家可以提供无热源或无内毒素的塑料制品。内毒素会牢固的吸附在玻璃制品上，并且在清洗的过程中也难以完全去除。实验室使用的标准灭菌步骤对内毒素几无效果。而且如何高压灭菌器之前曾用于细菌相关应用，反而会加重玻璃制品的内毒素污染。我们推荐将玻璃制品180℃高温烘烤过夜，以去除任何附着的内毒素分子。关于更多的去除内毒素的方法，请参考相应的文献。为了避免纯化得到的无内毒素DNA不会再次污染，请不要使用没有去除内毒素的试剂。