单细胞测序显示肝癌中浸润T细胞的景观图（Landscape of Infiltrating T Cells in Liver Cancer Revealed by Single-Cell Sequencing）
科学问题：
1.在过去的十年里，免疫治疗显著的改善了癌症治疗的状况，但对于不同的肿瘤病人或肿瘤类型，它的效果是不一致的。突变数量、肿瘤浸润的淋巴细胞和药物靶点表达等若干因素，虽然与抗CTLA4和抗PD-1病人的治疗具有相关性，但它们不稳定无法作为诊断标志物。因此，免疫治疗的改进和对治疗反应稳定预测的生物标志物的发现显得尤为重要。
2.肝癌是全世界癌症相关的死亡中主要源头，慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染是我国肝癌的主要原因。但是目前治疗手段有限且免疫治疗缺乏临床成功。
3. 参与肿瘤发生发展的免疫细胞类型多样且异质性很强，只有对浸润淋巴细胞进行单细胞测序分析才能更好的理解复杂的肿瘤微环境，真正获得系统详尽的肿瘤免疫图谱，从而有助于肿瘤免疫疗法的发展及有效靶点和生物标志物的发现。
研究策略：
对六位未进行治疗的肝癌病人的肿瘤样本，进行大量的外显子和RNA序列分析，以便获得基本表达特征。对来自外周血液、邻近正常组织和肿瘤组织的>5000个T细胞进行单细胞RNA测序分析，同时获得完整的TCR序列和转录组。通过生物信息学的算法和思想，基于分子的类型和功能对T细胞群进行亚型分类、发育轨迹分析以及各组织区域中相应亚群的T细胞数量分布，阐述肿瘤组织中T细胞的富集类型和来源。
研究结果：
在肝癌病人处，采集血液和肝组织（包括邻近的正常肝组织和肝癌组织），分别进行DNA/RNA提取和单细胞分离，获得大量的DNA/RNA序列和单细胞的转录组数据结果，从而可以绘制基因表达图谱和TCR序列图谱。同一位置、同一细胞类型的细胞聚类表明，同一患者不同淋巴细胞群具有不同的性质和内在结构。
为了揭示整体T细胞群体的内在结构和潜在的功能亚型，作者使用t-SNE的方法对所有T细胞进行无监督聚类。共出现11个稳定的细胞簇，其中CD8+簇5个，CD4+细胞簇6个。通过组织间不同簇中细胞百分比对比，发现CTLA4high的Tregs和耗竭的CD8细胞会在HCC中优先富集。
因为被富集的两类T细胞表达的共同抑制受体，如PDCD1和TIGIT，可以作为免疫治疗的靶点，作者有进一步分析了这些细胞类型，鉴定出肿瘤浸润Tregs中特异性表达的401个基因，这些HCC特异的Tregs基因与之前针对黑色素瘤、乳腺癌、结肠癌和肺癌的研究发现的基因有明显重叠。在上述的3项研究中，共有33个共同的Tregs信号基因，作者从获得数据中也鉴定出31个Tregs基因。之后，作者分析了浸润肿瘤的衰竭CD8+T细胞，通过与未衰竭的肿瘤T细胞对比，得到了82个shuaijie 特异的基因。
LAYN编码的layilin在肺和结肠肿瘤分离的Tregs中高表达，但对其功能特性还不了解。根据数据，作者发现LAYN在肿瘤Tregs(C8_CD4-CTLA4)和耗竭的TTC细胞(C4_CD8-LAYN)中均表现出高度特异性的表达模式，TCGA生存数据也表明，高表达的LAYN会减少预后病人的生存比率。经过验证，LAYN蛋白在Tregs和CD8+T细胞中可被诱导产生，其较高水平的表达对患者预后不良。
因为TCR经常被用作识别T细胞祖先的独特识别因子，作者利用5个HBV阳性肝癌患者的单细胞RNA-seq数据，通过TraCeR方法收集的全长TCR α链和β链的序列，用来追踪单个T细胞的族系。作者一共检测了94%的T细胞(3,792/4,032)的全部TCR序列，它们都至少有1个配对的生产性TCR α-β链可用于T细胞克隆分析，结果表明TCR序列信息可以与T细胞的不同状态对应，并支持HCC中CD8+T细胞和Tregs潜在的克隆扩增的观点。
完整的转录组数据以及T细胞的TCR序列能够深入了解肿瘤浸润T细胞的功能状态以及它们之间的关系。作者使用Monocle2算法使CD8+T细胞或CD4+T辅助细胞沿伪时间分布，刻画它们的发育轨迹。基于轨迹和TCR分析，作者推断耗竭的CD4和CD8 T细胞与各自发育中的表达GZMA基因的 T细胞亚群的关系比与效应T细胞亚群的关系更紧密相关。
肿瘤微环境中的T细胞易于耗竭或被Tregs（被调节性T细胞）抑制，从而阻止CD8细胞引发T细胞介导的肿瘤细胞杀伤作用。另外，肝癌微环境中大量扩增克隆的Tregs也许也是抑制效应CD8+ T细胞杀伤作用的原因。Tregs克隆富集现象表明，它们的TCRs可能识别肝癌抗原，这些Tregs克隆的扩增最有可能增强其免疫抑制功能，进一步限制了肿瘤浸润T细胞的效应功能。
研究结论：
该研究鉴定了肝癌组织中T细胞的11种亚细胞群，描绘了它们的发育轨迹。通过单细胞水平TCRs克隆分析可以推断这些亚型细胞在肿瘤微环境中的活化状态。证明了CCR8和LAYN是肝癌相关的标记基因，其中LAYN也与肿瘤浸润的CD8+T细胞的衰竭和预后不良有关。在来自人类血液的CD8+T细胞中过表达LAYN会导致IFN-γ显著减少。在亚群的发育轨迹中，C5_CD8-GZMK cluster位于效应T细胞和衰竭T细胞之间，猜测它可能是作为一种过渡状态。该研究也证明了GNLY+CD4效应T细胞和CX3CR1+CD8细胞具有相同的基因表达特征，暗示着CD4也有细胞毒性功能。MAIT细胞虽然在乙肝病毒感染时为表现出活化状态，但是它在肝脏抵御病原菌入侵的过程仍然有不容小觑的作用。研究过程中发现，MAIT细胞在肝癌组织中的含量明显少于近旁正常肝脏组织，这可能和它杀伤肿瘤细胞的功能有关，低表达MAIT细胞中的SLC4A10基因会是患者表现出预后不良。
研究评价：
该研究着重探索了衰竭T细胞和Tregs细胞的特异表达基因，发现基因Layilin在这两群细胞中均特异性表达，同时，基于TCR数据分析，该研究发现肝癌内存在大量肿瘤组织特异的克隆增生的T细胞，但是这些细胞大多处于耗竭状态，从而揭示了肿瘤细胞逃逸免疫监视的原因。此外，该研究还描绘了初始T细胞向耗竭状态的发展轨迹，并在耗竭性CD8 T细胞亚群中发现了一类FOXP3+抑制性T细胞的存在，提出了耗竭T细胞会进一步发展成抑制性T细胞的潜在发展方向。
通过对外周血、癌旁和肿瘤三个部位的T细胞进行采集分析，获得大规模的样本量，进行单细胞测序分析，聚焦肝癌新靶点和生物标记物的探索，针对肝癌组织内富含大量肿瘤浸润淋巴细胞、肝癌免疫治疗以及单细胞测序解决异质性问题。利用生物信息学方法，不仅仅只对T细胞亚群中的基因和蛋白进行差异化分析，还追踪了不同T细胞的来源和组织家谱，揭示了肿瘤中T细胞的转化过程，更加明了的阐述了疾病的发展情况。在系统生物学的角度，通过大量的组学分析，多方面多维度地对肝癌相关的T细胞进行表征研究，为临床治疗提供了过度状态的CD8细胞转回成效应T细胞和GZMA+ CD4细胞向溶解性CD4细胞转变这两种治疗方案，加速了新的免疫治疗的开创。
通过以前的研究和得到的数据分析出LAYN基因，作为T细胞的负调控因子，促进肿瘤的发生，具体的发生机理和生化反应有待进一步挖掘。C5_CD8-GZMK cluster作为过渡态，介导效应T细胞与衰竭T细胞的转变，该过程只是在发育轨迹中有所表现，还缺少真正的事实依据。