流式实验中的坑，我都帮你踩过了-第四坑

病例介绍

样本为培养的细胞系，洗涤后作为阴性细胞上机检测，该实验选择CytoFLEX流式细胞仪，分析软件为CytExpert。在实际检测过程中，发现认为是完全阴性的细胞群体在FITC，PE，PC5.5等通道上出现阴性和阳性的分群，而且荧光信号随着时间发生偏移。

小贝问诊答疑

虽然是培养的细胞系，培养的细胞出现污染、细胞自身表达荧光蛋白基因、药物处理后都可能出现某通道上有阳性表达。

策略：更换一批新细胞上机检测，且确认上述过程无污染、细胞不带荧光基因、不经过药物处理。然而该现象依旧存在，排除细胞问题。

分析过程中把碎片或其他噪音信号引入，在荧光通道上把噪音信号当作阴性细胞，阴性细胞当成阳性。

策略：检查分析流程，碎片信号和细胞信号区分明显，荧光通道上散点图的阴性不是由噪音信号产生，如下图。排除分析问题。

仪器硬件问题，这次意外都发生在仪器的蓝激光检测的通道，初步怀疑蓝激光或检测光路出现问题导致一系列事故发生。

策略：选择质控微球，进行仪器质控，并在该方案下检测微球信号，观察质控微球随时间变化情况。仪器质控正常，而且方案中的质控微球在time参数图中信号稳定，未出现漂移现象，如下图。所以排除仪器问题。

某蓝激光激发染料污染管道，在上样管道有非常大的残留，可对上样的阴性细胞进行染色。

策略：检查荧光通道的time参数图，如下图，随着时间增加荧光信号逐渐增加，慢慢达到信号高值保持不变，如下图，类似配体-受体结合的时间曲线，污染的可能性增大。同时咨询仪器最近使用情况，近期有进行PI染色的细胞周期实验，基本确定是PI污染。

小贝处方

PI染料虽然用着方便、简单、便宜，但可能给管路清洗带来很大麻烦。另外，不仅仅是PI，其他如7-AAD等核酸染料均存在黏附液流管路的风险。出现这种情况我们需要加大管路冲洗或更换上样系统。

清洗方式选择Beckman Coulter的CLENZ清洗液清洗一段时间，然后更换蒸馏水清洗，时间越长越好，直到清洗干净为止。如果一种方法无法满足，可以使用DNA溶液清洗管路，如鲑鱼精DNA溶液或者放置很长时间的外周血样本，由于细胞基本都碎了，白细胞释放出大量DNA。

如果上样清洗不能清洗干净，有条件可将上样针、蠕动管拆卸下来进行注射冲洗。清洗干净或更换干净的上样管路，重新进行细胞上样，结果恢复正常，如下图。

思维发散区

提问：流式检测中，常常用PI试剂排除死细胞，避免死细胞引起的偏差，但PI不适合用于固定的细胞，那有没有一种染料适合固定的样本排除死细胞，它的原理是什么？

大家可以根据自己所学流式知识思考一下，欢迎大家填表问答，我们将送出“磁性计时器“，答案下期公布。