单细胞DNA做基因捕获，要注意什么？
作为领先的基因捕获解决方案提供商，艾吉泰康会接到形形色色的基因捕获的定制需求。其中有一类恰好是当下非常火热的单细胞相关的。很多客户咨询，单细胞扩增后的DNA如果拿来做捕获测序，需要注意哪些问题呢？今天，小艾将相关问题汇总整理一下。
1. DOP-CPR[1] or PEP[2]：基于简并引物或者15nt完全随机引物的扩增，技术均发表于1992年，目前有成熟的商业化试剂盒。
2. MDA[3]：基于Phi29聚合酶和随机六碱基引物的等温扩增，发表于2002年。目前仍在使用。有两个方向的技术改进，一个是将单细胞的DNA分散至大量的微液滴中（eMDA[4]和ddMDA[5]），另一个是使用特殊的引物合成酶（TruePrime[6]）。两个改进均提高了扩增的均一性。
3. MALBAC[7]：谢晓亮老师组2013年发表，PCR产物形成发卡结构，抑制后续的PCR扩增，可以较好解决扩增不均一的问题。
图一 三种单细胞扩增方法原理图示[8]
4. LIANTI[9]：谢晓亮老师组2017年发表，基于Tn5转座酶连接上带有T7启动子序列的接头，并采用T7 RNA聚合酶进行体外转录来扩增核酸。
图二 LIANTI技术原理示意图[9]
单细胞全外捕获的技术问题
1. 真实有效深度：人是二倍体生物，单个细胞的染色体拷贝只有2个。因此，单细胞扩增产物在测序时，不论测序深度是多少，起原始的DNA分子来源都是2个。如果是生殖细胞，则只有1个拷贝。而普通的测序中，每1X的深度都代表一个原始的DNA分子（因为去dup，多重扩增子除外）。这是单细胞测序最大的不同之处。
2. DNA产物总量问题：LIANTI的产物总量较少，谢晓亮老师的论文中提到，有20ng左右。片段长度的分布则取决于Tn5转座酶插入时的间隔。MDA的DNA产出较多，能达到μg级别甚至10μg级别，且长度能达到kb级别。二代测序有低起始量建库试剂盒，这个DNA的总量是足够的；如果是三代建库，LIANTI的总量还是不够，需要增加扩增产量。
3. 覆盖度问题：这个是在分析时会带来最大麻烦的地方。很多检测需求是真·单细胞测序，比如胚胎植入前检测，扩增用的模板来自一个细胞的DNA，那么考虑到细胞扩增前的分选和处理，很难保证DNA没有断点。这种断点的位置，是无法扩增出来的。既然无法扩增出来，也就无法检测到这个断点附近的序列。比如谢晓亮老师的论文中提到，在25X的平均测序深度下，不同的方法的全基因组覆盖度有72%左右的，也有85%~93%的。我们检测的客户样本也看到了类似的现象，用全外检测（平均深度约100X），覆盖度高的可以超过90%，低的也有百分之二三十的。
4. 均一性问题：单细胞DNA必须经过扩增，而PCR是有不均一性的。事实上，根据LIANTI的论文，单细胞扩增的均一性很难达到和bulk cells样本一致的水平。因此，在测序结果中，过分强调均一性指标（0.2X mean depth coverage或者Fold 80罚分），只会感觉技术指标过差。
图三 不同单细胞扩增技术的扩增均一性比较[9]
5. Duplication问题：一般的全外捕获测序，我们认为dup主要来自于PCR过程，并不提供样本的真实突变信息。在单细胞DNA测序时，由于必须进行DNA扩增，因此建库时的DNA全部都是PCR产物。分析时去除dup，可以消除建库、捕获时的PCR不均一对碱基分型频率的影响，但需注意，在单细胞扩增时的不均一是无法通过去dup来消除的。
好啦，以上是小艾总结的单细胞DNA扩增产物做捕获测序时可能存在的问题，欢迎大家继续提问~
参考文献
1. Telenius H , Carter N P , Bebb C E , et al. Degenerate oligonucleotide-primed PCR: general amplification of target DNA by a single degenerate primer.[J]. Genomics, 1992, 13(3):718-725.
2. Zhang L, Cui X, Schmitt K, et al. Whole genome amplification from a single cell: implications for genetic analysis[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 1992, 89(13): 5847-5851.
3. Dean F B, Hosono S, Fang L, et al. Comprehensive human genome amplification using multiple displacement amplification[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2002, 99(8): 5261-5266.
4. Fu Y, Li C, Lu S, et al. Uniform and accurate single-cell sequencing based on emulsion whole-genome amplification[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2015, 112(38): 11923-11928.
5. Sidore A M, Lan F, Lim S W, et al. Enhanced sequencing coverage with digital droplet multiple displacement amplification[J]. Nucleic acids research, 2016, 44(7): e66-e66.
6. Picher A J, Budeus B, Wafzig O, et al. TruePrime is a novel method for whole-genome amplification from single cells based on Tth PrimPol[J]. Nature communications, 2016, 7(1): 1-16.
7. Zong C, Lu S, Chapman A R, et al. Genome-wide detection of single-nucleotide and copy-number variations of a single human cell[J]. Science, 2012, 338(6114): 1622-1626.
8. Gawad C, Koh W, Quake S R. Single-cell genome sequencing: current state of the science[J]. Nature Reviews Genetics, 2016, 17(3): 175.
9. Chen C, Xing D, Tan L, et al. Single-cell whole-genome analyses by Linear Amplification via Transposon Insertion (LIANTI)[J]. Science, 2017, 356(6334): 189-194.
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