这家医院怎么啦？30个新冠标本竟检出27个阳性，真相是......

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作者||俞彤

前言

PCR实验反应的特点是具有较大的扩增能力与极高的灵敏性，但令人头痛的问题是易污染，极其微量的污染即可造成假阳性的产生。面对众多的污染源，比如样本、试剂仪器、克隆质粒、PCR扩增产物、还有极容易忽视的气溶胶污染，气溶胶是由固体或液体介质点分散并悬浮在气体介质中形成的胶体分散体系，在空气与液体面摩擦时，比如在操作时比较剧烈地摇动反应管，开盖时、吸样时及污染进样枪的反复吸样都可形成气溶胶而形成污染。这样的污染悄无声息，防不胜防【1】。对于目前从事新冠检测的PCR实验室，发现污染并迅速解决也是很重要的一个能力。

案例经过

今天我们如往常进行新冠病毒的筛查工作，第一板标本曲线做的很漂亮，阴阳对照、内部质控都符合要求。但是在第二板标本的扩增曲线出来以后，我和同事都傻了眼，几乎每个样本N基因的扩增曲线都是阳性！仅有少数几条逃脱了“厄运”。

我的第一反应：O基因怎么样！因为我们知道，O基因的特异性比N基因要强一些，不易受其他冠状病毒的干扰。

当发现是阴性的时候，我的心放了下来，“十有八九是污染导致的，”我和同事异口同声。

那下面的工作，就是分析污染原因了。

案例分析

我们有句玩笑话：发生PCR实验室污染的时候，你不要试图找到原因，因为根本找不到。说明在分析污染原因时，有很多细节性的问题需要注意，以下为我们的分析过程。

我们对该次实验阴阳对照是否符合要求进行判断。本次实验使用上海之江科技股份有限公司三靶标试剂，可检测N基因、ORF1ab基因和E基因。阳性判读规则为ORF1ab（+）且N/E至少一个（+），内对照（±）；阴性判读规则为三靶标均（-），内对照（+）。复检规则：仅ORF1ab（+）；仅N/E单靶（+）【2】。本次分别做了阴性对照、阳性对照以及两个无模板对照。

阴性对照

无模板对照1

无模板对照2

发现阴性对照和无模板对照的N基因出现了和标本同样的问题，但是另外两个通道是正常的。分析到这儿，这次实验其实已经失败了，需要重新提取。

但是我们提出这样一个疑问，到底是哪一个环节出现的问题呢？如果实验室已经被污染，重新提取也没有意义了。所以我们又将目光锁定在“似阳非阳”的N基因的扩增曲线上。

如果是阳性质控或者扩增产物的污染，不会只出现单N基因阳性的情况；如果是提取过程的污染，那么也应该是第一板出现问题，而非第二板；说明书上说，当Ct值≤38时，判为阳性，仔细观察标本的Ct值，却几乎都是在36与41之间，这不就是弱阳性的范围吗？是弱阳性的室内质控污染？同事此时突然想到，提取完室内质控后，由于两个八连管的盖子出现裂缝，她就去处理这件事情，而没有及时处理，弱阳性的室内质控大概暴露在安全柜内十五分钟的时间。基于之前的经验，室内质控N基因的Ct值大概在30左右。

我们立即联系工程师询问这种情况是否会造成污染，得到了肯定的答复：第一，实验室温度大概在25℃，高于平时20℃的实验温度，很可能造成扩散；第二，气溶胶污染；第三，在第一轮实验结束后，没有对安全柜进行消毒，给了污染可乘之机，而且不符合操作规范。

我们听后马上对加样用的生物安全柜以及柜内物品进行处理，75%酒精擦拭，并紫外线照射。

再对标本进行复查，曲线正常，为阴性。

总结与讨论

相信从事PCR检测的老师们或严重或轻微，都遇到过实验室污染的问题，虽然头疼，但也是这种实验方法难以避免的问题。所以在平时的工作中，一定要注意细节，规范操作。目前多数分子实验室（不仅是新冠实验室）每天都在大规模进行，污染源已经无处不在。特异性的，非特异性的，同源的，非同源的，广泛分布在样本容器、实验室台面，试剂溶液中、仪器表面内管附着等等。【3】针对不同的污染，需要采取不同的处理方式，当然大多数情况下，需要多管齐下，比如：

1、75%酒精擦拭：将核酸沉淀，擦拭后保证被污染表面得到一定程度的缓解（简单、方便、成本低）。

2、修饰：标记遗传物质，阻止聚合酶与核酸的结合，从而抑制DNA扩散（效果相对较好）。

3、酶解：酶可将长链的核酸分子降解成小片段（速度快、效果效果相对相对较好）。

4、高压变性：高压可以将核酸降解成20-30bp的小片段（彻底、成本低）。

5、紫外照射：PCR产物中嘧啶碱基会形成二聚体，延伸终止（方便、范围广、成本低）。

参考文献

【

参考文献：

【1】陈永，杨莲辞，常定发.PCR实验室的污染及其防范措施〔J〕.山东畜牧兽医. 2021,42(03)

【2】上海之江科技股份有限公司三靶标试剂说明书

【3】朱一帆，时超杰，李莎莎，何敖林.精准医学背景下关于临床PCR扩增实验室存在的不足及反思〔J〕.中国卫生产业. 2019,16(26)