肠·道 | 金梅林：19分钟详解双歧杆菌的抗流感潜力
大家好，我来自武汉华中农业大学。感谢热心肠研究院邀请我在这个平台与大家分享近期的一项研究《肠道益生菌——内源性动物双歧杆菌的抗流感作用》。
有关流感，大家都不陌生。流感主要分为甲型、乙型、丙型三种类型，其中甲型（A 型）流感病毒最容易发生变异。甲型流感既能感染人，又能感染动物。
据世界卫生组织估计，每年流感的季节性流行可导致全球出现 300 万到 500 万重症病例，25 万到 50 万人死亡。
近年来，H5、H7 高致病性禽流感感染人死亡率高，危害严重。2009 年，甲型 H1N1 流感在全球大流行，再一次证实了猪是人、禽和猪流感的混合器，尤其是 2009 年，该亚型在人群中流行尤为严重，比季节性流感感染人数还要高得多。
至今 A 型流感仍然严重危害人类健康和公共卫生安全，并造成巨大的经济损失。
甲型流感病毒先后导致了 1918、1957、1968 和 2009 年共 4 次全球性的流感大流行。流感病毒通过跨宿主迁移和基因重配引起的抗原转移是造成流感大流行的主要原因。
比如 1918 年的流感，全球将近 10 亿人感染，5000 多万人死亡，超过了第一次世界大战的死亡人数，死亡率为 2%~3%。
2014 年的最新研究表明，1918 年的流感就是人流感和禽流感病毒基因的重配所引起的大流行。
我们在生活中通常会发现一个有趣的现象，就是说个体和个体之间的异质性，有的人对流感的抵抗力很强，而有的人对流感的抵抗力却很弱。
这涉及到两个方面，一个方面就是机体对病毒的清除能力，第二个方面就是机体对疾病的耐受性。
当机体感染流感后，往往会出现三种感染形式：
一种是被感染后，能够快速地清除体内的病毒。
第二种就是虽然清除病毒的能力有限，但是能够通过各种方式减少机体损伤，这些人对流感的抵抗力就相对较强。
第三种形式是未能清除病毒和未能耐受免疫介导的损伤，这样的人群就是我们经常说的易感人群。
说到这里，我们不禁要问：个体的异质性又是由哪些因素决定的呢？
这里面包括了遗传因素以及非遗传因素。遗传因素是由基因层面决定的，它是与生俱来的，不可更改的。非遗传因素则是机体生存的外界环境因素，而肠道微环境中的微生物在其中扮演了至关重要的角色。
说到肠道微环境，不禁要引申到肠道的粘膜免疫，它是参与构成机体免疫防御的第一道防线，就像万里长城。
肠道内含有弥散的淋巴组织、集合淋巴小结以及淋巴细胞、巨噬细胞和浆细胞等等。当肠道粘膜受到病原作用时，随即产生免疫应答，并向消化管内分泌免疫球蛋白，以抵御细菌、病毒以及其他有害抗原物质的侵入，从而构成了肠粘膜的免疫系统。
粘膜表面与外界抗原——比如食物、共生菌、有害的病原体等等的直接接触，在抵抗感染方面起到了极其重要的作用。
目前，肠道微生物广泛影响了机体各项机能以及疾病的发展，肠道微生物的重要地位已被广泛地认可。
肠道菌群的变化不仅会影响局部细胞功能和免疫反应，而且在呼吸系统疾病中也有着重要的作用。比如，肠道菌群与流感病毒感染的免疫反应有着密切的关系。
那么，肠道微生物与流感之间具体有什么样的关系呢？
流感感染除了能引起肺部损伤，还能引起肠道菌群结构改变，并会引发肠道疾病。这个作用机制目前还不清楚，但是越来越多的研究表明，健康的肠道菌群对于抵御肺部感染至关重要，形成了肺肠轴——一道看不见的 Crosstalk 相互响应。
然而具体是哪些菌群、哪些分子参与了这一过程仍然未知。
因此，我们为了进一步了解是哪些细菌在流感感染中发挥了重要的作用，进行了深入的研究。
为了验证肠道菌群是否直接影响了机体对流感的敏感性，我们设计了如下实验：
选取一批小鼠，用相同剂量的 H7N9 流感病毒进行感染，在感染的第 3 天和第 9 天分别采集每只小鼠的粪便，并根据小鼠的编号分别存放。
待感染第 15 天后，根据小鼠死亡情况，将小鼠分为存活组和死亡组，然后对提前采集的小鼠粪便也进行了对应的分组。
接下来，我们利用抗生素处理的小鼠进行粪菌移植实验。具体的方案就是先将小鼠进行抗生素处理 3 天，在停药 1 天后，按照相应的分组对小鼠进行粪菌移植，1 天后对所有组别的小鼠进行攻毒，并评估各组小鼠的流感抵抗力。
有趣的是，在我们的研究结果中发现，移植存活组小鼠的粪便菌群，不管是感染后第 3 天的，还是感染后第 9 天的，均可以增加小鼠对流感的抵抗。
相反，移植死亡组小鼠感染后期——也就是说第 9 天的粪便菌群，则降低小鼠的抵抗，导致小鼠 100%的死亡。
这提示了：存活组小鼠的肠道菌群中包含某些抗流感的细菌；相反，死亡组小鼠的肠道中包含某些促进流感感染的细菌。
那么，怎么知道哪些特定的菌群影响了流感病毒感染小鼠的死亡和存活呢？这就绕不开目前已经在肠道微生物领域得到广泛应用的高通量测序技术。
基于这个目的，我们首先利用 16S rRNA 测序分析存活组和死亡组肠道菌群在属水平的差异。为了进一步了解差异的菌种，我们采用宏基因组测序技术进行深入地挖掘。
通过 16S rRNA 测序，我们发现，流感感染的严重程度不同，会导致不同的肠道微生物变化，特别是某些益生菌在流感抵抗力高的个体中明显上调，而在抵抗力低的个体中明显下调，例如双歧杆菌和乳酸菌。
结果提示，机体对流感抵抗力的不同，与双歧杆菌和乳酸菌等等益生菌显著相关。
既然已经聚焦到某个特定的菌属，接下来我们希望能够更精确地找到在流感感染中发挥重要作用的菌种。
因此，我们采用了宏基因组测序技术进行深入地挖掘，通过共现网络分析以及热图分析发现，流感抵抗力高的个体富集了更多的假长双歧杆菌和动物双歧杆菌。
基于上述结果，我们进行了随机森林分析，并计算了变量对随机森林分类器的精度的贡献，建立了在预测流感感染的预后和严重程度方面，具有诊断潜力的分析模型。
换句话就是说，我们可以通过测定菌群的变化来预测机体感染流感后的发展走向。
那么，双歧杆菌是否真的能够影响机体对流感的抵抗能力呢？
我们首先在抗生素处理小鼠模型上进行了验证。结果表明，抗生素处理小鼠接受单独的动物双歧杆菌灌胃或假长双歧杆菌和动物双歧杆菌共同灌胃后，都显著提高了抗流感的能力，包括显著提高了存活率以及减轻体重丢失。
值得注意的是，假长双歧杆菌和动物双歧杆菌共同灌胃处理的抗流感效果更为明显。
接下来，我们又在无菌小鼠模型上进行了验证。结果显示，用动物双歧杆菌给无菌小鼠单独灌胃以及两种菌共同灌胃，都发挥了相似的抗流感效果。
综合这些结果表明，动物双歧杆菌发挥了直接的抗流感作用，在非无菌环境下，假长双歧杆菌对动物双歧杆菌的抗流感作用具有辅助的作用。
为了探索动物双歧杆菌是如何发挥抗流感作用，我们采用双歧杆菌灌服三天，分别取肺脏和血液，对相关的免疫指标进行了分析。
结果表明，灌服动物双歧杆菌会促进抗病毒细胞因子的表达，包括 β 干扰素和 γ 干扰素；而灌服动物双歧杆菌会下调“炎症风暴”相关的细胞因子，包括TNF-α、IL-6 和 IL-1β。
由此可见，动物双歧杆菌通过调节免疫应答，帮助机体抵抗流感感染。
另外，对各组实验小鼠进行了安乐死，解剖后观察肺脏的病理变化。
在感染第 7 天，与 PBS 灌胃组和假长双歧杆菌单独灌胃组相比，动物双歧杆菌单独灌胃，以及假长双歧杆菌和动物双歧杆菌共同灌胃，显着降低流感感染后肺部病理损伤的程度，有效地减弱了肺脏炎性细胞的侵润。
既然动物双歧杆菌可以抗流感，那么它的效应分子是什么？为了回答这个问题，我们继续进行了功能宏基因组的分析。
我们发现在感染第 2 天所富集的功能通路中，动物双歧杆菌特有的功能包括缬氨酸、异亮氨酸和赖氨酸的生物合成，以及辅酶 A 的生物合成。
结果表明，缬氨酸、异亮氨酸、赖氨酸以及辅酶 A，可能是动物双歧杆菌发挥抗流感作用的关键分子。
为了评估上述分子的抗流感效果，我们利用小鼠感染模型进行了验证。
小鼠经口服给予缬氨酸、异亮氨酸和赖氨酸，以及腹腔注射辅酶 A。结果发现，灌服缬氨酸以及腹腔注射辅酶 A，可以显著提升小鼠对流感的抵抗力，包括提升存活率、减少体重丢失、降低病毒载量、改善肺部损伤等等。
进一步研究结果表明，灌服缬氨酸可以通过显著降低肺脏的病毒载量，促进抗病毒细胞因子的表达，包括 β 干扰素和 γ 干扰素，下调“炎症风暴”相关因子TNF-α、IL-6 和 IL-1β。
这些结果提示，缬氨酸是通过调节感染后机体免疫应答来抵御流感的。
腹腔注射辅酶 A 可以显著降低肺脏的病毒载量，在感染当天就迅速激活 TNF-α、IL-6、IL-1β 和 γ 干扰素的表达。
不同于缬氨酸，辅酶 A 是通过提前激活先天免疫应答来抵抗流感的。
下面对上述工作做一个小结。
我们的研究为从肠道菌群中筛选特异性的功能菌株，提供了一个直接且有效的方法。
鉴定了新的具有抗流感作用的益生菌与功能小分子，为抗流感微生态制剂以及抗流感的药物开发奠定了基础。
建立了一种利用肠道微生物变化预测流感感染愈后或严重程度的计算模型。
重要的是，我们证明，宿主能够通过增加其内源性的动物双歧杆菌，来抵抗流感感染。宿主对其肠道微生物的这种主动利用形式，不仅反映了一种全新的抗流感机制，同时也增加了我们对肠道菌群与宿主相互作用的认知。
尽管研究者们，也包括我们自己团队研究，在我们所涉及的这样的领域做了大量的工作，但人类与流感病毒的博弈一刻也不能放松。
由于流感病毒易变异，使得人们和动物缺乏免疫力、缺乏对新发流感的特效药物和疫苗、呼吸道传播不易控制、传播迅速、自然分布广等等这样的一些问题，始终警示人们要时刻面临着未知的 HxNy 的流感病毒大流行的威胁和挑战。
因此，在科学研究方面还需不断地探索新型疫苗预防和治疗性的药物，同时在流感流行季节有必要采用补充一点益生菌来调节免疫系统功能，帮助机体对抗流感及相关并发症等综合性的预防措施。
另一个人类社会面临的巨大的威胁是耐药性的问题，抗微生物药物的误用和滥用会加快形成耐药性。
据估计，到 2050 年，耐药的问题导致的经济损失共计将会达到 100 万亿美元，而每年因耐药问题死亡的人数将达到 1000 万。
由于长期大量的使用抗生素导致的细菌耐药性与日俱增，过量的抗生素使用会造成功能损伤和胃肠道反应，引起机体的菌群失调。
在养殖环节中，抗生素作为饲料添加剂使用，用于动物疾病的治疗，易引起不良反应，而导致动物生产性能下降，疾病增加，产生抗生素残留，对人类生活所必需的肉、蛋、奶造成了严重的影响。
为了人类生存的生态圈和谐健康，合理地使用疫苗免疫获得有效的保护力的同时，减少抗生素及抗病毒药物的使用。
在后抗生素时代，肠道微生物及其代谢小分子已经成为众多疾病治疗和预防性制剂筛选的“天然储存库”。生物治疗性制剂的开发和科学的使用方兴未艾。
通过饲料端“禁抗”，养殖端“减抗”、“限抗”，促进养殖环节的安全环保，最终保障人类健康。
最后，感谢参与本项目研究的各位研究生，感谢动物生物安全三级实验室的支持，感谢《肠·道》平台。谢谢各位。