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Screening and validating the immune-related gene expression signatures in peripheral blood mononuclear cells of nonischaemic cardiomyopathy非缺血性心肌病外周血单核细胞免疫相关基因表达特征的筛选与验证
一、研究背景
已有大量的证据表明，激活的免疫反应可引起心肌不良的重构，而非缺血性心肌病(NICM)患者外周血单个核细胞(PBMC)的失调也被证实与患者预后存在相关。作者希望在本研究中筛选并验证PBMC的相关生物标志物并探讨其影响患者预后可能的机制。
二、研究流程
三、结果解析
1.差异表达基因(DEG)筛选
在本研究中，作者使用GEO2R在线分析工具对GEO数据库中3个健康样本和4个NICM样本PBMC的转录情况进行了比较。在对GSE9128的芯片数据进行分析后，作者共筛选得到371个DEG(P<0.05，|logFC|≥1，288上调，83下调，图1A)。热图中展示了Top10上调和Top10下调的DEG的表达情况(图1B)。在这371个DEG中，Top5上调以及Top5下调的DEG的相关信息展示于表1。
图1A.健康样本与NICM样本的DEG；图1B.Top5上调和下调DEG在不同样本中的表达情况
表1.Top5上调/下调基因的相关信息
2.GO与KEGG富集分析
为深入了解上述DEG，作者使用DAVID数据库及配套工具进行了GO富集分析(2A-C)，发现在生物过程(BP)层面，上调的DEG主要富集于炎症反应、免疫反应、脂多糖反应、细胞对机械刺激的反应和翻译过程的负向调控，而下调的DEG则富集于基因表达的昼夜调节、序列特异性DNA结合转录因子活性的负调控、天然免疫反应、细胞对过氧化氢的反应和I-κB激酶/NF-κB信号的负调控。对于细胞组成(CC)来说，上调的DEG主要富集在胞外外泌体，细胞核，膜以及核质和胞浆中，而下调的DEG则富集在细胞核，核质，中心体和转录因子复合物中。在分子功能(MF)层面，上调的DEG主要负责ATP结合、poly(A)RNA结合、染色质结合、核苷酸结合和GTP结合，而下调的DEG可能在蛋白质结合、线粒体解偶联和细胞因子活性方面发挥作用。
为了获得关于上述DEG的更多相关信息，作者还通过DAVID数据库进行了KEGG富集分析(图2D)。发现下调的DEG在内质网、军团菌、NF-κB信号通路、NOD样受体信号通路、雌激素信号通路中富集，而上调的DEG在炎症性肠病(IBD)、TGF-β信号通路、神经营养素信号通路和EB病毒感染中富集。
图2A-C.对DEG进行的GO富集分析结果展示；图2D.对DEG进行的KEGG富集分析结果
3.枢纽基因和代表性模块的探索
此外，作者通过Cytoscape软件分析发现15个枢纽(hub)基因处于蛋白-蛋白互作(PPI)网络的核心位置，这些基因互相存在密切联系。作者基于公共数据库STRING和上述15个枢纽基因构建了PPI网络(图3A)。在这15个枢纽基因中，只有一个基因(JUN)在NICM患者的PBMC中显著下调，而其他基因在PBMC中显著上调。值得注意的是，JUN不仅是与其它蛋白互作关系强度最高的DEG，还是fold change最高的下调DEG。此外，这15个枢纽基因可以直接与371个中的149个DEG相互作用，枢纽基因之间也有相互作用，尤其是JUN和CREB1。此外，作者还使用MCODE插件来检测PPI网络中的功能模块并确定了评分值最高的前2个模块——模块1(图3B)与内质网中的免疫反应和蛋白质加工有关，模块2(图3C)与炎症的信号通路和细胞反应有关。总的来说，PPI网络表明，上述15个枢纽基因，特别是JUN和CREB，可能在NICM的免疫反应中发挥重要作用。
图3A.通过Cytoscape软件进行的PPI分析结果(图示15个枢纽基因)；图3B，C.PPI网络中的两个评分最高的功能模块
4.异丙肾上腺素诱导的小鼠模型中基因的验证
为了进一步确证GSE9128芯片的数据并进行进一步的研究，作者通过qPCR在异丙肾上腺素诱导心肌损害的小鼠模型中重新鉴定了Top5上调基因和Top5下调基因(图4)。qPCR结果表明，NICM小鼠PBMC中EGR3、MBNL1、PTGS2、EGR2和TXNIP的mRNA表达水平明显高于对照组(P<0.05)，而NICM组GABARAPL3、NPIPB3、RGS1、CREM和JUN的mRNA表达水平明显低于对照组(P<0.05)，与通过生信分析得出的DEG结果相互印证。
图4.在异丙肾上腺素诱导心肌损害的小鼠模型中测定前文中Top5上调基因和Top5下调基因的表达情况
5.探讨PBMC亚型中DEG的表达情况
此外，作者还检测了PBMC亚型中Top5上调基因和Top5下调基因的mRNA水平。目前已知PBMC主要包括T细胞、B细胞和单核细胞。因此，作者主要探讨了这10个基因在CD4+T细胞、CD8+T细胞、CD14+单核细胞和CD20+B细胞中的mRNA水平(图5)。发现EGR3主要在NICM小鼠T细胞中表达。单核细胞中MBNL、PTGS2和EGR2均较高，而NICM小鼠的表达明显较高。TXNIP主要表达于CD4+T细胞，CD8+T细胞和CD20+B细胞，在NICM存在下其表达显著增加。关于下调基因，作者发现JUN在正常受试者的T细胞中高表达，而在NICM小鼠的T细胞中其水平降低，但在B细胞中增加。CREM主要在T细胞中表达，而NICM小鼠T细胞中CREM水平降低。RGS1主要在正常小鼠的B细胞中表达。与NICM小鼠相比，正常小鼠T细胞和单核细胞NPIPB3水平较高。四种免疫细胞中GABARAPL3的mRNA水平在正常小鼠中始终高于NICM小鼠。
图5.前文筛得的Top5上调基因和Top5下调基因的mRNA水平
小结
作者将常用于肿瘤学的DEG筛选、GO和KEGG富集分析以及蛋白互作网络预测等方法应用于非缺血性心肌病的相关研究，并且进行了动物实验进行验证，可以说是较为成熟的干湿实验结合套路，但作者将前述套路套用到非缺血性心肌病外周血单个核细胞失调的研究中，思路新颖。不过作者在文章中并未对某一具体通路进行探究，具体的相关机制还有很大的挖掘空间。