编译：寒江雪，编辑：夏甘草、江舜尧。
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导读
在进化水平上很久远的一种植物激素受体复合物，它包括促生长因子/包折叠水解酶KARRIKIN INSENSITIVE 2（KAI2）和F-box蛋白MORE AXILLARY GROWTH 2（MAX2），介导了karrikins (KARs)的烟源丁烯内酯和内源性KAI2配体（KLs）的发育反应。MAX21抑制因子(SMAX1)在配体感知后的降解是KAR/KL信号转导的关键步骤。目前对SMAX1去除后如何调节植物生长的分子机制还尚不清楚。本研究证明了百脉根SMAX1在KAI2和MAX2的存在下被特异性地降解，并且在调节根和根毛的发育中起着重要的作用。smax1突变体初生根非常短，根毛细长。对根进行转录组分析显示乙烯反应和编码乙烯生物合成中的限速酶ACC合成酶7(ACS7)表达升高。smax1突变体释放的乙烯量增加，其根表型可通过乙烯生物合成和信号抑制剂的处理而挽救。KAR处理诱导ACS7表达依赖于KAI2，根发育对KAR处理的反应依赖于乙烯信号。在拟南芥中，KAR诱导的根毛伸长依赖于ACS7。因此本研究揭示了KAR/KL和乙烯信号之间的联系，其中KAR/KL信号模块(KAI2-MAX2-SMAX1)调节乙烯的生物合成，以微调根和根毛的发育，这些研究结果对植物生活史开始时的幼苗生长是十分重要的。
原名：The karrikin signaling regulator SMAX1 controls Lotus japonicus root and root hair development by suppressing ethylene biosynthesis
译名：Karrikin信号调节因子SMAX1通过抑制乙烯生物合成来控制百脉根根和根毛的发育
期刊：PNAS
IF：9.58
发表时间：2020.6
通讯作者：Caroline Gutjahr
通讯作者单位：慕尼黑大学生物学系
DOI号：10.1073/pnas.2006111117
本研究对百脉根中SMXL蛋白家族进行家族分析，及SMXL蛋白家族在不同组织部位的表达情况。利用本氏烟草进行瞬时转化研究SMAX1降解特性。通过构建SMAX1突变体，测定初生根和根毛长度，乙烯含量等表型分析该基因的功能。对突变体的根进行转录组测序分析与野生型间的差异基因并选择18个进行表达量的验证。通过对黄化幼苗进行了下胚轴三重反应试验验证乙烯生物合成增加对幼苗的萌发的影响。研究人员构建了百脉根(L.japonicus)、拟南芥(A.thaliana)、苜蓿(Medicago Truncatula)、高粱(Sorghum Biolor)、水稻(Oryza Sativa)SMXL蛋白序列的系统发育树鉴定百脉根中的SMAX1。与其他非十字花科双子叶植物相似，百脉根基因组并不包含所有拟南芥SMXL基因的同源基因，这表明双子叶植物中的SMXL基因复制和丢失事件。在Strigolacone信号分支(SMXL7a、SMXL7b、SMXL8)中有3个SMXL，其中SMXL7a、SMXL7b和SMXL8起源于一个共同的祖先基因，该基因在拟南芥和百脉根中独立复制。百脉根基因组中未发现SMXL5，但存在SMXL3和4以及另外一个SMXL9。SMXL基因在百脉根叶、茎、花和根中的转录积累不同。SMAX1转录本在所有组织中持续积累，而SMXL7a、SMXL7b和SMXL8转录本在叶、茎和根中积累水平较高，在花中积累水平较低。SMXL3、SMXL4和SMXL9转录水平普遍较低。2 SMAX1是百脉根中KAR受体复合物的蛋白水解靶点拟南芥SMXL6、7和8及其水稻直系物D53在GR24处理后以依赖于D14和MAX2的方式降解，Karrikini诱导的、依赖于KAI2和MAX2的拟南芥SMAX1和SMXL2降解。为了验证百脉根SMAX1是否是KAR/KL受体复合物的特异性蛋白水解靶点，研究测试了百脉根KAI2和MAX2存在下，在瞬时转化的本氏烟草叶片中的稳定性。在质粒强启动子调控下，百脉根SMAX1-GFP（绿色荧光蛋白）与MAX2和α/β-折叠水解酶受体KAI2a、KAI2b或D14中的一个共表达，该质粒还含有一个游离mCherry表达盒作为转化标记（图1A）。SMAX1-GFP在共表达MAX2和Strigolacone受体D14的叶表皮细胞的细胞核中清晰可见（图1B和E）。相反，即使没有KAR处理，在MAX2和KAR/KL受体KAI2a或KAI2b存在的情况下也没有观察到GFP信号，这表明SMAX1在存在两种KAI2亚型时被特异性地降解。分析其他GFP标记的SMXL即SMXL8和SMXL3、4和9的稳定性，研究了SMAX1降解的特异性。在D14和MAX2存在的情况下没有检测到SMXL8-GFP，但当D14与KAI2a或KAI2b交换时，检测到SMXL8-GFP积累(图1B和E)。SMXL3、4和9的GFP融合标签在所有条件下都有积累，表明它们在MAX2存在的情况下既不是KAI2的靶标，也不是D14的靶标。SMAX1和SMAX l8的降解都依赖于百脉根MAX2的存在，因为即使在同源α/β折叠水解酶受体存在的情况下，这两种融合蛋白也会在没有百脉根MAX2的情况下积累在细胞核中（图1C和F）。尽管存在MAX2和同源的α/β-折叠水解酶受体，百脉根SMAX1(GKTAF)和SMXL8(GKTTI)的相应基序的缺失使得SMAX1d53-GFP和SMXL8d53-GFP在本氏烟草叶表皮细胞的细胞核中积累（图1D和E）。SMAX1在KAI2a或KAI2b和MAX2存在下被特异性降解，而SMXL8在D14和MAX2存在下被特异性降解。
图1 SMAX1在KAI2和MAX2存在下被特异性降解。A质粒示意图。B-C 共聚焦显微镜图像。D氨基酸缺失示意图及融合蛋白定位图。通过系统发育分析和降解实验明确鉴定出百脉根SMAX1后，鉴定SMAX1反转录转座子(LORE1)插入突变体(34个)，以研究SMAX1在百脉根发育中的作用。有三个突变体(SMAX1-1，SMAX1-2，SMAX1-3)在该基因的第一个外显子中插入。SMAX1-1发芽缺陷，所以本研究重点研究SMAX1-2和SMAX1-3。KAR/KL标记基因DLK2的转录本在两个等位突变体的根中高水平积累，证实SMAX1是无功能的（图3B）。两个等位基因SMAX 1突变体都表现出苗根强壮的表型（图2）。胚根（PR）长度明显缩短，胚后根数（PER）包括侧根和不定根数与野生型相似导致PER密度增加（图1A和B）。这种表型与SMAX1中纯合子LORE1插入的相关性，通过共分离分析和SMAX1-2插入的群体分离得到证实（图1C）。在72个个体中，13株是SMAX1-2位点的纯合子野生型，44株是杂合子，15株是纯合子突变体，符合孟德尔式的分离。除了PR长度缩短外，SMAX1突变体根毛更长，平均长度是野生型的3倍（图2D和F）。第一根根毛出现位置离根尖中心更近（图2E），探究SMAX 1突变体较短的PR长度和与第一根毛之间的距离是否是由根细胞伸长缺陷引起的。在根尖区域的纵向切片显示，SMAX 1突变体根尖以上的过渡区肿胀，细胞致密。比较SMAX 1与kai2a、kai2b、smax1三重突变体，三重突变体包含了SMAX 1的PR和根毛表型，表明smax1对kai2a和kai2b具有完全上位性。与先前报道的拟南芥kai2突变体表型相反，百脉根kai2a kai2b突变体的根与野生型相似，没有较长的PR，仅有略短的根毛。
图2百脉根smax1突变体的初生根减少，根毛长度增加。A萌发10d表型图。B-C野生型、smax1-2和smax1-3的初生根长度、胚后根数和单位密度。D根尖的代表性图像。E-F野生型，smax1-2和 smax1-3的第一个RH到Qc(E)的距离和RH距离顶点(F)1.5~2 mm处的RH长度。种子养分储备对幼苗早期发育和生长至关重要。SMAX1突变体较小的根系可能是由于种子储备减少所致。测量纯合和杂合SMAX 1亲本的种子重量，并测量它们的二维面积。纯合SMAX1突变体的种子比野生型种子轻约25%，小约25%，而分离自杂合双亲的种子平均重量、大小和大小分布中等。这增加了SMAX 1突变幼苗生长受到其种子养分(例如碳)供应减少的影响的可能性。在培养基中添加1%的糖尽管促进野生型的初生根的生长，但是并不能挽救SMAX1的根生长。因此与野生型相比，SMAX1突变体的每株密度仍然较高，糖供应减少不太可能是导致SMAX 1根表型的原因。磷饥饿也可以导致PR长度缩短。由于SMAX1根表型是在低浓度磷酸盐(2.5μM)的培养基上观察到的，因此SMAX1根表型可能是对磷酸盐饥饿敏感的症状。SMAX1突变体的根系生长不能在含高浓度磷的培养基上恢复。野生型植株的PR长度变短，而SMAX1的PR长度保持不变。磷肥条件对两种基因型的粒数和粒密度没有影响。说明SMAX1根系表型不是由低磷有效性引起的。根的表型不是由种子储备养分决定的，但种子较小可能是由于母株较小导致的对两个等位基因SMAX 1突变体和KAR/KL感知突变体kai2a，kai2b和max2的根进行转录组测序。SMAX1中有4420个差异基因（DEG），其中有2511个共有DEG。在kai2a、kai2b和max2根中，总共发现了2431个DEG，在这些突变体中有765个共有DEG，是KAR/KL信号转导靶标候选基因。所有突变体中共有506个DEG。只有4个DEG在kai2a、kai2b和max2中与SMAX 1突变体的调控方向相反。一些基因在SMAX1突变体中表达失调，但在kai2a、kai2b和max2突变体中，与野生型没有显著差异。选择18个基因进行qRT-PCR验证转录表达模式（图3B）。
图3百脉根KAR/KL信号突变体的差异基因表达。A DEG的层次聚类分析。B DLK2和ACS7基因在不同基因型根中的转录积累。6 乙烯生物合成基因ACS7在SMAX1突变体中表达升高对5340个DEG进行分层聚类和GO注释分析（图3A），所有突变体都在“细胞壁代谢过程”功能下富集。SMAX1突变体转录本在次生代谢物加工的解除调控，如类黄酮、类固醇和苯丙烷代谢过程特异表达，而kai2a、kai2b和max2转录本正在异戊二烯和萜类生物合成过程显著富集。SMAX1突变体中注释到转录调节、对生物刺激的反应、分生组织维持和对激素刺激的反应，特别是对生长素和乙烯的反应有关等功能。簇6中几个AP2转录因子基因被注释为乙烯反应因子(ERFs) (图3A)，其中包含smax1突变体中上调的基因，以及与拟南芥ACS7同源的acc合成酶基因（图3B）。研究中鉴定了百脉根基因组中所有ACS基因(和相应的蛋白序列)，并通过转录组数据计算其表达量。发现ACS7表达量的增加可能解释了smax1根的表型。7 smax1的根系生长抑制是由乙烯生物合成增加引起的利用气相色谱检测ACS7表达增加是否导致smax1突变体乙烯生物合成增加。两个smax1突变体的乙烯含量都至少是野生型的2.5倍（图4A）。然而，SMAX1突变体通过乙烯前体ACC(1-氨基环丙烷-1-羧酸)和ACC生物合成抑制剂AVG(氨基乙氧基甘氨酸)对乙烯生物合成的药理学干扰反应与野生型类似（图4A）。为了了解提高乙烯水平是否会导致百脉根初生根变短和根毛伸长，研究人员用乙烯前体ACC和乙烯释放化学物质乙烯利处理野生型幼苗。通过这种处理，野生型重现了smax1根和根毛的表型。用AVG或用硝酸银阻断乙烯感知的处理，使得两个等位基因smax1突变体恢复了野生型样的初级根和根毛的发育（图4B-F）。说明SMAX1突变体中乙烯的过量产生导致了初生根和根毛发育的缺陷。
图4 乙烯产生增加引起smax1突变体的初级根和根毛表型。A气相色谱法测定野生型、smax1-2和是smax1-3幼苗乙烯释放量及对0.1μM AVG或1μM ACC处理的响应。B-C在50μM硝酸银存在下生长的10d龄野生型和smax1-3幼苗的PR长度、每数和每密度的代表性图像(B)和测量值(C)。D-F 在50μM硝酸银或0.1μM AVG存在下，野生型和smax1-3幼苗的根尖(D)的代表性图像以及第一RH与QC之间的距离(E)和RH长度(F)的测量值。8 乙烯生物合成增加不影响SMAX1突变体的下胚轴发育为了了解SMAX1突变体中乙烯生物合成增加是否也会影响幼苗的萌发，研究人员对黄化幼苗进行了下胚轴三重反应试验。smax1突变体没有表现出结构性的三重反应，但它们对剂量依赖的方式添加ACC浓度的增加有与野生型类似的反应。黑暗生长和光下生长的smax1下胚轴都比野生型短，而且AVG和硝酸银都不能恢复这一表型。但是在SMAX1突变体中acs7转录本积累增加。这表明百脉根SMAX1突变体中乙烯生物合成的增加特异性地影响了根，可能是因为下胚轴对乙烯的敏感性低于根。此外，乙烯信号以外的机制影响smax1突变体的下胚轴伸长。AVG和硝酸银处理后，通过qRT-PCR检测了8个DEG的表达，从而检验了smax1根中的转录产物是否是乙烯的次要反应。AVG和硝酸银处理均能抑制smax1突变体中3个基因的转录积累，表明它们的表达增加是乙烯依赖的。三个AP2转录因子基因的转录本在不依赖乙烯抑制剂处理的smax1突变体中过度积累。为了验证乙烯信号非依赖性的smax1的DEG是否是KAR/KL信号转导的早期靶标，研究人员分析了它们在KAR1处理2小时和6小时后在根中的表达。确认了DLK2是一个早期的KAR反应基因，还发现了两个KAR/KL标记基因。如果ACS7的表达增加是SMAX1去除的直接结果，那么这个基因的表达也应该通过KAR处理野生型根来诱导。KAR1以KAR/KL受体依赖的方式诱导ACS7转录积累在2h后略有增加，在处理6h后显著增加。研究利用硝酸银和KAR1共处理野生型植物来检验这种效应是否依赖于乙烯信号。KAR1单独处理抑制了PR的生长，增加了PER密度，但与硝酸银共处理时没有观察到这一现象。ein2a、ein2b乙烯感知突变体对KAR1处理没有反应，PR生长减少，证实发育的影响需要乙烯信号。乙烯产量的增加是对KAR感知的一种下游反应，证明了KAR1对百脉根PR生长的影响需要乙烯信号。ACS7的异位表达导致拟南芥根毛生长增加。拟南芥smax1smxl2双突变体在野生型中表现出根毛长度的增加和KAR诱导根毛的伸长。smax1、smxl2双突变体的PR也略短于野生型。研究人员探究了SMAX1、SMXL2对ACS7转录本积累的负调控在拟南芥根中是否保守。在smax1smxl2突变体中，DLK2和ACS7转录本积累比野生型水平更高。而拟南芥acs7-1和ein2-1突变体对KAR处理不能增加根毛伸长。因此，研究人员证明ACS7介导的乙烯的产生和感知对拟南芥KAR/KL信号下游的根毛伸长是必需的，并且KAR/KL乙烯信号模块在拟南芥和拟南芥之间是保守的。植物幼苗生长需要依赖根和根毛的发育以固定在地面上，并迅速获得生存和生长所需的养分和水分。小分子信号通路的负调控因子“karrikin信号”在调控豆科植物莲花根系生长中起着重要作用。SMAX1的突变体初生根较短和较长的根毛。说明该表型是由促进乙烯生物合成引起的，而在野生型中，乙烯生物合成被SMAX1抑制。因此，karrikin信号调节乙烯的生物合成来微调根的发育。
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