科研 | PLANT CELL ENVIRON：创新的转录组揭示非模式豆类作物物候、生长和产量的环境响应基因
编译：秦时明月，编辑：景行、江舜尧。
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狭叶羽扇豆(Lupinus angustifolius L.)是一种粮食作物，既是一种绿肥，也是动物饲料和人类食物的蛋白质来源。在驯化过程中，许多农艺性状都得到了改良，但迄今只定位到两个性状相关基因，这两个基因都是通过连锁作图获得的。采用基因组测序的全基因组关联分析(GWAS)至今还没有定位到任何新的候选基因。
本研究采用了一种新颖的3'端简化表达转录组分析方法-大规模cDNA末端分析，对126个狭叶羽扇豆品系进行了田间表达分析。该研究所分析的所有物候期和产量性状均存在显著的基因型与环境互作。主成分分析表明种群结构是驯化的瓶颈。GWAS为破译豆科植物春化途径做出了贡献，除突出已知的驯化位点外，还发掘了与狭叶羽扇豆性状相关的基因。早期物候期与春化、冷耐性和磷脂酰肌醇的免疫途径有关，而高产性状则与控制光合作用和非生物胁迫(干旱或高温)耐性的基因有关。本研究开发和验证了基于PCR的标记筛选方法，以便能够在标记分析中追踪到所需的等位基因。
论文ID
原名：Innovative transcriptome-based genotyping highlights environmentally responsive genes for phenology, growth and yield in a non-model grain legume
译名：创新的转录组揭示非模式豆类作物物候、生长和产量的环境响应基因
期刊：PLANT CELL AND ENVIRONMENT
IF：4.192
发表时间：2020年9月
通讯作者：Michał Książkiewicz
通讯作者单位：波兰科学院
DOI号：10.1111/pce.13880
实验设计
结果
研究人员连续两年在波兰的两个地点获得了一组126份狭叶羽扇豆的表型数据。不同年份间观察到的表型平均值之间的差异是显著的，而除成熟度和TGW外，不同地点之间的差异也是显著的。年份和地点之间的互作对所有的性状来说都是显著的。研究人员在用方差分量相对于其标准差的大小来评价产量时，发现品种间的方差较低，通过SIMILA评价，品系与年份之间以及品系与地点之间的交互作用较大。广义遗传力系数(表1)较高，除产量(26.7%)外，其余均在70-85%之间。因此，试验间的平均遗传相关系数较高，TGW达70%，末花期、成熟度、株高达75~76%，始花期达85%，成熟度与株高呈极显著正相关(P<0.05)。图1记录了开花、落花和结实的最早日期，这可归因于该地区2016年4月和5月的相对高温。在同一试验中，产量和TGW值最高，株高最低。从产量水平来看，上述温差并不影响春化，也可能是较低的温度和降水组合更适合产量形成。野生或原始品系的花期和成熟期比其他类型的品系晚(图2)，其它品种平均开花早、产量高。各试验株系间的相关关系表明，这些性状与植株高度在所有试验中也存在显著的相关性，但是其相关值较低。
2 MACE基因分型产生了基于大规模基因的标记，并为欧洲狭叶羽扇豆驯化的瓶颈提供了新的证据
MACE法找出了175033个单核苷酸多态性标记，其中2842个符合GWAS条件：缺失率<30%，次要等位基因频率(MAF)>0.2，杂合性观察数<80%。78.9%的SNPs(2242个)注释到1305个基因，每个基因的SNP数目在1-14个之间(图3A)。注释基因的SNP位置在5'端上游162bp到3’端下游200bp之间(图3B)。绝大多数序列位于3'非编码区和CDS尾部100-200nt之间，符合MACE方法学原理。其他区域的一些序列的存在突显了狭叶羽扇豆基因组注释的推测的不完备性。因此，用于GWAS的标记总数为2852个，不同染色体的标记数目不同。NLL-01、NLL-02、NLL-04和NLL-10有200多个标记，NLL-03、NLL-06、NLL-09、NLL-11、NLL-13和NLL-16在100~200个标记之间，NLL-08、NLL-14和NLL-17在50个标记以下。标记和品系的杂合度分布如图3C和3D所示，标记配对的连锁不平衡系数(LD)随其物理高度的增加而降低(图3E)；群体的选择和结构对连锁的一些影响大约发生在基因组7 Mb和17 Mb水平上。
利用标记数据(图4)对群体结构进行主成分分析，并根据IR估计的KINS对材料进行聚类，结果表明狭叶羽扇豆属植物育种过程中存在驯化瓶颈，表现为来自不同国家的育种材料和品种群体。事实上，研究人员发现来自波兰，德国和乌克兰的一些育种材料展现出非常紧密的聚类。另外，来自德国，波兰和白俄罗斯的品种和繁育系形成了一个远离其他主产区的地方种质。
3 全基因组关联作图揭示所有性状显著的基因型与环境互作
GWAS分析显示452个标记的多态性与数量性状的变异显著相关，这些标记可以归类到247个基因(每个基因1-10个标记)。由GWAS分析得到的曼哈顿曲线图如图5所示，每个性状的SNP标记关联数量从TGW的3个到产量的227个不等，分配的基因数量从TGW的3个到产量的117个不等(表2)。
始花期和TGW的所有关联都表现出与环境的交互作用。互作标记的比例从始花期的100%下降到末花期的63.8%，到成熟期的52.2%(表2)，有97.8%的等位基因效应与环境的交互作用是定量的，即所有等位基因效应的取值不同，但等位基因效应在实验中是恒定的；2.4%的等位基因效应在所有4个实验中都是不存在的，而在所有的试验中，元素效应的值都是恒定的(除2个成熟度关联和11个产量关联外)。
4 显著相关序列的注释揭示了大量参与环境响应的基因
根据基因组注释和文献资料，GWAS鉴定的与品系差异显著相关的基因被归入部分功能类别。根据计算的P值和指定的基因数(表3)，影响开花的主要基因是响应环境信号启动开花时间的可识别基因，其次是具有各种调控功能的基因和参与非生物胁迫反应的基因，花期与成熟性状也出现了同样的情况。这种高遗传力、高基因相关性的试验(表1)和大量与环境相互作用的标记(表2)，突出了解决环境因素的途径在植物物候学中的关键作用，并相应地改变了遗传控制效应。株高与许多未知功能的基因序列有关，也与执行基本生命功能、促进生长、生物量和产量生产的基因有关，并在一定程度上与生物胁迫反应有关。
产量在相关基因的功能多样性中表现出非常复杂的关系，该组分主要包含一些未知功能的序列，以及参与各种调节和基本细胞生命途径、非生物胁迫响应、光合作用表现和效率、生长、生物量和叶产量、共生相互作用和节发育的基因。此外，来自防御反应、基本和定向抗性途径以及那些控制开花时间启动的基因对产量性状也有显著的贡献。这些结果，再加上计算出的遗传力和遗传相关值，揭示了控制叶绿体对影响植物生长、物候、健康和生产力的众多内外因素的遗传网络(表3)。本研究所发现的大量产量数量性状位点(QTL)很像是这一性状潜在遗传复杂性的结果，这在这些试验中的系列变异很大。
5 关联分析突出了主要的驯化位点，为标记辅助选择提供了新的候选基因
从10个与四倍体驯化基因连锁的STS标记中，3个标记揭示了与至少一个表型变异性不相关联 (表 4)。结果表明，1个STS标记与1个驯化基因连锁。标记早花位点的标记LanFTc1_INDEL2与所有性状相关，表现出与物候性状关联的最高分值。4次平均试验发现，LanFTc1_INDEL2与播种到发育 (生殖器官发育、开花结束和成熟)所需的时间短、总种子产量和千粒重(TGW)值高以及株高较低相关联。始花期和株高的等位基因效应在4个试验中是一致的。但其余性状与环境存在显著互作，两年内产量效应方向相反。
通过分析LanFTc1_INDEL2与其他标记的互作比，进一步阐明了LanFTc1_INDEL2对性状水平的所有效应，以及它们对其他多态性的依赖性。在对许多性状表现显著非全效效应的标记中，有两个标记SNLL-02_2314384和SNLL-02_2314385定位于蛋白磷酸酶2C家族蛋白Lup022595。
6 基于PCR的分子标记辅助选择工具的开发与关键调控基因的验证
选择在GWAS中具有最高分值的单核苷酸多态性(SNPs)的始花期和株高的基因进行基于PCR的标记开发(表5)。由于得分值低，没有选择末花期和TGW基因进行分子标记。LanFTc1基因的开花成熟度得分最高，但是没有被选中，因为该序列的一对基于PCR的标记已经被前人鉴定过。在所选基因中，Tanjil 等位基因对LanFTc1(物候性状和产量)、Lup021909(物候性状)和Lup021835(产量)有潜在的农艺效应，而对Lup019134、Lup021911、Lup004734和Lup004718(物候性状)、Lup022535(产量)、Lup012504(株高)中这些重要农艺性状的不良等位基因的存在，展示了通过植物基因型辅助的传统育种进一步改良狭叶羽扇豆作为作物的机会。
为了能够挖掘全部基因，研究人员开发了基于PCR的10个基因阵列，这些基因携带有最强的性状与基因型关联的SNPs。PCR产物测序证实，所有标记的扩增区域均存在MACE方法确定的多态性位点。此外，在6个标记中还发现了一些新的多态性(Indels和SNPs)。研究人员设计了19个CAP、1个dCAPS和1个Indel标记，用于区分参考值和变异值。对126个品系进行PCR检测，除2个标记外，其余设计的标记均为阳性。利用这些基于PCR的基因分型数据对GWAS进行了重新计算，结果证实了该阵列在标记选择中的适用性(表6)。
结论
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