科研│PLANT J:番茄果实成熟过程中基因组甲基化，非编码RNA，mRNA和代谢物含量间的相关性分析（国人佳作）
编译：微科盟 东方不赢，编辑：微科盟景行、江舜尧。
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番茄果实的成熟是一个紧密协调的复杂生长过程，涉及多种生理过程和代谢变化。成熟使果实更诱人，可口，富有营养。成熟过程需要启动，激活和协调转录和转录后水平上的协调关键途径，促使乙烯合成和下游决定成熟质量的事件。研究者在编码和非编码转录组，代谢组学和基因组甲基化水平上研究了野生型，Gr和r突变体水果，鉴定并定量了许多差异表达的非编码RNA，并构建了潜在的内源RNA竞争调控模型。基因甲基化的许多变化都与乙烯调节途径和成熟过程有关。对基因组甲基化，长非编码RNA，环状RNA，microRNA和果实代谢产物的变化进行的综合分析显示，许多差异表达基因（DEG）的甲基化区域的编码的转录因子和关键酶，与乙烯或类胡萝卜素途径可能靶向的差异表达的非编码RNA相关。其中一些重要基因包括ACO2（以MSTRG.59396.1和miR396b为靶标），CTR1（以MSTRG.43594.1和miR171b为靶标，ERF2（以MSTRG.183681.1为靶标），ERF5（以miR9470-3p为靶标），PSY1（以MSTRG.95226.7为靶标），ZISO（以12：66127788 | 66128276靶标）和NCED（以MSTRG.181568.2为靶标）。本研究了解这种复杂的内源遗传调控网络的功能，可以为潜在的整合多个决定成熟的表型的事件之间的关系提供新的理解。
论文ID
原名：Relationships between genome methylation, levels of non‐coding RNAs, mRNAs and metabolites in ripening tomato fruit
译名：番茄果实成熟过程中基因组甲基化，非编码RNA，mRNA和代谢物含量间的相关性分析
期刊：The plant journal
IF：6.141
发表时间：2020年4月
通讯作者：王清 &James J. Giovannoni
通讯作者单位：北京市农林科学院蔬菜研究中心蔬菜保鲜与加工&博伊斯·湯普森研究所
DOI号：10.1111/tpj.14778
实验设计
结果
1 野生番茄果实成熟过程的多组学分析
研究者对野生型Ailsa Craig果实和相同年龄的Gr和r突变体进行了深度测序和生物信息学分析，其中非编码RNA和DNA甲基化可影响与将成熟的绿色水果转变为红色过程中的乙烯反应，类胡萝卜素合成和其他成熟的过程的mRNA浓度。比较WT果实的成熟绿色和红色成熟阶段，通过topGO和KEGG途径分析来注释6486个DE mRNA（2296个上调mRNA， 4190个下调mRNA）。包括编码与乙烯生物合成，信号传导和反应途径有关的几个关键基因的mRNA表达上调：ACS2 / 4，ACO5，NR，CTR1，EIN3/4，ERF1 /2/6，PSY1，ZISO和MADS-box TF 23被下调，ACS3，ACO4，LCY2和类胡萝卜素积累途径基因，包括Delta，NCED5，CCD1A / 4和ERF1/2/5/12/13，与之前的研究一致。
研究者发现在野生型果实成熟过程中有100个miRNA，378个lncRNA和65个circRNA差异表达。其中，有44个miRNA，160个lncRNA和42个circRNA被上调，而有56个miRNA，218个lncRNA和23个circRNA被下调（图1a，b，附录S1）。通过基因本体论（GO）和KEGG途径分析来分析WT绿色和红色成熟水果的DE miRNA，lncRNA和circRNA的潜在靶标。根据序列同源性鉴定了许多靶基因，这些靶基因已知可能与果实成熟过程有关，包括谷氨酸代谢途径、单萜类生物合成途径、果胶分解代谢过程、植物激素信号转导、淀粉和蔗糖代谢、氨基酸的生物合成和甘油磷脂代谢途径（附录S1）。此外，还鉴定出具有潜在靶标的miRNA，lncRNA和circRNA，例如ACS4，ACO2，CTR1，ERF5，ERF13和MADS-box转录因子，它们都与乙烯的生物合成和信号转导相关（表1）。还发现了其他miRNA和lncRNA可能编码细胞壁修饰有关酶的潜在靶向基因：CesA（纤维素合酶），PE（果胶酯酶），PG（聚半乳糖醛酸酶）和PL（果胶裂合酶），它们参与番茄果肉质地的形成（表1）。此外，miRNA和lncRNA的其他可能靶标还包括谷氨酰胺合成酶和谷氨酸脱羧酶，它们参与了番茄风味的形成（表1）。有趣的是，一个可能的circRNA（12：66127788 | 66128276）靶标是15-顺式-ζ-胡萝卜素异构酶（ZISO），它是番茄色素积累中的重要酶。研究者还发现许多参与激素信号传导和合成途径的靶标，例如脱落酸，生长素，茉莉酸和赤霉素（表1，附录S1）。此外，研究者鉴定出可在果实成熟过程中充当miRNA的ceRNA的DE circRNA，lncRNA和mRNA，并建立了ceRNA网络（图1c，d）。许多关键的非编码RNA具有在水果发育和成熟过程中发挥关键作用的可能靶标，包括MADS-box 23，ERF5，ERF13，ERF021，PG，PL，PE，CesA和谷氨酰胺合成酶。
图1.野生型（WT; Ailsa Craig）番茄果实中差异表达（DE）非编码RNA和mRNA和ceRNA网络的分布。（a）成熟绿色与红色成熟阶段之间的DE circRNA，miRNA，lncRNA，mRNA的数量。（b）DE circRNA，lncRNA，miRNA和mRNA在不同染色体上的分布。（c），（d）WT果实成熟过程中circRNA，lncRNA，mRNA和miRNA的ceRNA网络。
最近，一些非编码RNA（如lncRNA和miRNA）已显示通过调节植物中的DNA甲基化而发挥功能。为了揭示非编码RNA在DNA甲基化中的潜在作用，比较了果实成熟过程中的表观基因组动力学和非编码RNA序列的变化。通过比较野生型水果成熟绿色和红色成熟阶段的数据，共发现了CG，CHG和CHH类型的3500、16 891和84 162 DMR在成熟过程中表达的基因有重大变化（图2a–d）。KEGG通路分析表明，这些差异表达基因（DEG）中的许多都与植物激素信号转导过程有关，与果实成熟密切相关（图2e–g）。将DMR和DEG结合分析，发现一些DMR和DEG与乙烯的合成、信号传导和响应途径、色素积累和果实质地有关（附录S2）。结合DMR和DE lncRNA分析发现，lncRNA可能靶标许多成熟相关的差异甲基化基因，例如CrtR-b（胡萝卜素β羟化酶;由MSTRG.156253.2靶向），CTR1（由MSTRG.44159.1靶向），ERF2（由MSTRG.183681.1靶向），ERF3（由MSTRG.26451.1靶向），ERF024（由MSTRG.43594.1靶向），ERF061（由MSTRG.201251.2靶向），ERF086（由MSTRG.17850.2靶向）和MADS-box TF23（由MSTRG.24366.15靶向）。此外，对DMR和DE miRNA的共同分析也表明它们参与了果实成熟过程的调控。例如，miR159靶向ACS8，miR396b靶向ACO2，miR9470-3p靶向ERF5和ERF021，miR482a靶向PL，谷氨酸合酶1靶向9474-5p（附录S2）。
图2. 甲基化水平：DMR的差异甲基化区域（DMR）分布和KEGG通路分析。（a）–（c）对野生型（WT）果实的成熟绿色和红色成熟阶段之间的DNA甲基化水平进行聚类分析。（d）DMR的注释及其在WT成熟的绿色和红色成熟阶段之间的分布。（e）-（f）WT果实成熟绿色和红色成熟阶段之间DMR的KEGG通路分析。
使用了基于LC-MS / MS的代谢谱分析方法，分析得到成熟的绿色与红色成熟水果之间过程中分别有361种不同的代谢物增加和219种代谢物减少（附录S3 ）。转录组和代谢组学分析相结合表明，主要途径的改变与氨基酸（L-色氨酸，L-缬氨酸，L-丙氨酸，L-谷氨酸，L-亮氨酸，L-组氨酸）的生物合成，丙酮酸苯酯，半乳糖（蔗糖和半乳糖醇）代谢，和许多参与类黄酮生物合成的代谢物（绿原酸，菊花和柚皮苷）以及抗坏血酸和藻酸盐（L-阿拉伯糖），维生素B6（4-吡啶氧酸）和谷胱甘肽代谢途径（L-焦谷氨酸，L-谷氨酸和谷胱甘肽）有关，可能有助于番茄中的风味积聚。
2 WT和乙烯敏感性Gr突变体果实的ncRNA和mRNA差异性分析
Gr果实细胞对乙烯不敏感，并具有已改变的成熟反应。研究者比较了WT和Gr突变果之间的编码和非编码转录组，表观基因组和代谢组，以探索两种基因型之间的差异，并更多地了解乙烯生产的分子基础。研究者发现了在野生型果实和Gr突变体之间有34个miRNA，171个lncRNA，33个circRNA和3711个mRNA差异表达。其中14个miRNA，90个lncRNA，10个circRNA和2732个mRNA被上调，而20个miRNA，81个lncRNA，23个circRNA和979个mRNA被下调（图3a–c，附录S4）。
图3.野生型（WT；Ailsa Craig，AC）和Gr突变体之间差异表达（DE）非编码RNA和mRNA的差异。（a）WT和Gr突变体之间差异表达的microRNA（miRNA）。（b）WT和Gr突变体之间的DE长非编码RNA（lncRNA）的差异。（c）WT和Gr突变体之间差异表达的环状RNA（circRNA）。（d）WT和Gr突变体之间差异表达的mRNA。
使用GO和KEGG途径分析了DE miRNA，lncRNA和circRNA的可能靶标，结果表明lncRNA参与了单萜类生物合成和果胶分解代谢过程，这可能与果实的风味和质地有关，而circRNAs参与胺代谢过程。 miRNA靶点的KEGG途径结果突出了植物激素信号传导和淀粉和蔗糖代谢中基因表达的差异，表明它们在果实成熟过程中的独立或复合作用（附录S4）。作者研究了非编码RNA的靶标DE，发现许多与乙烯途径有关，例如ACS4，ACO2 / 5，MADS-box TF，ETR2，CTR1，EIN3，ERF2 / 7和ERF109。此外，还确定了参与果实色素积累的lncRNA的多个靶标，例如β-胡萝卜素羟化酶（CrtR-b1和CrtR-b2）和9-顺式环氧类胡萝卜素双加氧酶（NECD）。此外，两个lncRNA（MSTRG.85242.1和MSTRG.85242.2）的靶标为green ripe-like 2，表明它们参与了乙烯信号途径和类胡萝卜素的积累（附录S4）。
研究者在WT红色成熟果实和Gr突变果实之间发现很大差异，鉴定出3711个DE mRNA，其中2732个被上调，而979个被下调（图3d；附录S4）。DE mRNA的topGO结果表明，它们主要参与光合作用，氧化还原以及类胡萝卜素、叶绿素和单萜类生物合成，表明WT和Gr突变体之间存在特异性差异。通过KEGG分析发现了一些代谢途径中的mRNA，这些途径包括碳代谢，植物激素信号传导，淀粉和蔗糖代谢以及苯丙烷类生物合成（图3c，附录S3）。对DE mRNA数据的分析表明，与Gr突变体相比，WT的许多参与乙烯途径的基因上调，例如GR，ACO2 / 4，EIN3，EIN4，ERF1和ERF038 / 054，而且许多基因被下调。与WT2相比，Gr突变体中的ACS2，ACO5，NR，ERF1 / 2/4/6和ERF096 / 114的比例更高。此外，一些参与类胡萝卜素积累的基因也显示出不同的表达水平，例如β-胡萝卜素异构酶D27（Dwarf27），LCY1，NECD5，CCD4，CRTISO和ZEP上调，而ZISO，PSY1和脱落酸8'-羟化酶1被下调。此外，与独脚金内酯信号传导途径有关的独脚金内酯酯酶DAD2与Gr突变体（附录S4）相比在野生型中也被上调。
3 WT和Gr突变体果实DNA甲基化差异分析
已发现参与调节番茄果实中乙烯响应的TF存在DNA甲基化，研究者选择WT红色成熟体和Gr突变体进行RNA测序，以探索DNA甲基化与乙烯感知和信号传导之间的关系。在AC红色成熟果实和Gr突变果实之间（附录S5）分别发现了分别为57 961个CG甲基化，31 901个CHG甲基化和75 268个CHH甲基化的DMR。将DMR和DEG一起解析。确定一些DMR和DEG与乙烯的生物合成和信号转导有关，例如ACS2，ACO2，ACO5，MADS-box TF，NR，GR，EIN3，ERF1 / 2/4 / 7，ERF038，ERF054，ERF096，ERF114和ERF119（图4a–c，附录S5）。有趣的是，还发现了几种DMR和DE mRNA与果实色素的积累有关，例如ZISO，LCY1，CrtL-e-1，NECD和NSY（附录S5）。
图4.综合分析野生型（WT）和 Gr突变体果实中与乙烯代谢途径有关的的DMR, DEG，lncRNA DMR与DE。（a）–（c）WT果实和Gr突变体之间绿色成熟突变体（GR，Solyc01g104340.1），乙烯受体永不成熟突变体（NR，Solyc09g075440.2）和乙烯响应转录因子114（ERF114，Solyc03g118190.2）的DMR和DEG的比较。（d）-（f），WT果实和Gr突变体之间的MSTRG.59396.1（靶标Solyc12g005940.1，ACO2），MSTRG.181568.2（靶标Solyc07g056580.2，ETR2）和MSTRG.183681.1（靶标Solyc08g007230.1，ERF2）DMR和DE lncRNA分析。
研究者共同分析了AC红色成熟果实和Gr突变体之间的DMR和DE lncRNA，结果表明，几种差异甲基化的lncRNA参与靶向乙烯和类胡萝卜素途径，例如MSTRG.59396.1（靶标ACO2和ERF7），MSTRG.111174.1（靶标ACO5），MSTRG.44159.1（靶标CTR1），MSTRG.181568.2（靶标ETR2），MSTRG.183681.1（靶标ERF2），MSTRG.60188.1（靶标ERF017），MSTRG.43594.1（靶标ERF024），MSTRG .201251.2（靶标ERF061），MSTRG.39825.1（靶标ERF109），MSTRG.111733.1（靶标ERF114），MSTRG.94590.4（靶标CrtR-b2），MSTRG.162893.1（靶标NSY）和MSTRG.181568.2（靶标NCED）（图4d–f；附录S5）。在某些情况下，DMR和DE miRNA之间存在关联，例如与乙烯或果实色有关，例如miR171b（靶标CTR1），miR9470-3p（靶标ERF5和ERF021），miR477-3p（靶标EIN3-like）和miR5300（靶标ZISO）（附录S5）。
4 WT和Gr突变体果实代谢产物差异分析
研究者通过代谢谱分析来测量红色成熟的野生WT果实和Gr突变体果实之间代谢产物的差异。总共发现了在阳性模式中，有289种不同的代谢产物（与Gr突变体相比，WT中有85种上调和204种下调），在阴性模式中，有204种不同的代谢产物（与Gr突变体相比，WT中有51种上调和153种下调）。结合转录组和代谢组分析，研究者鉴定出属于不同KEGG途径的34种和28种不同的代谢产物。与Gr突变体相比，WT中呈阳性模式的6个途径的6种不同代谢物被上调，而28种途径的28种不同代谢物被上调。此外，WT中呈阴性模式的属于四个途径的四种不同的代谢产物被上调，而属于24种途径的24种不同的代谢产物被下调。几种差异积累的代谢物主要参与氨基酸的生物合成，2-氧代羧酸代谢，苯丙氨酸类生物合成，苯丙氨酸代谢，抗坏血酸和藻酸酯代谢以及类黄酮生物合成，其中许多与风味化合物有关（附录S6）。
5 类胡萝卜素缺失的野生型和r型突变果实之间的非编码RNA和mRNA差异
PSY1是负责番茄果实类胡萝卜素合成的关键生物合成酶。为了进一步了解番茄果实中类胡萝卜素的形成，研究者对WT和r突变体之间的编码和非编码转录组，表观基因组和代谢组进行了分析比较来探索类胡萝卜素的调控作用。
研究者发现WT和r突变体果实之间差异表达的24个miRNA，13个lncRNA，15个circRNA和113个mRNA，包括与r突变体相比，WT中有16个miRNA，6个lncRNA，6个circRNA和89个mRNA上调在和8个miRNA，7个lncRNA，9个circRNA和24个mRNA下调。研究者分析了DE miRNA，lncRNA和circRNA的潜在靶标，令人惊讶的是，发现许多ncRNA参与了乙烯途径，例如lncRNA MSTRG.89359.1，它潜在地靶向了编码乙烯生物合成关键酶的ACO4，并且靶向ACO3的circRNA（9：69299833 | 69300656）（附录S7）。
lncRNA和mRNA GO分析表明，几个lncRNA靶标及其mRNA也参与了单萜类生物合成，氧化还原，果胶分解代谢和多胺分解代谢过程。进一步的KEGG通路分析结果表明，许多DE miRNA和lncRNA靶标都参与了植物激素信号转导通路。具体来说，miR172a，miR482e-5p和miR9472-5p的可能靶标分别是AP2-ERF-TOE3，ERF-WRI1和SBP 7，它们在果实成熟过程中起着重要作用。
6 WT和r突变体果实DNA甲基化差异性分析
为了探索DNA甲基化的功能，研究者选择了AC WT红色成熟果实和r突变果实进行测序和进一步分析（图5a）。在WT红色成熟果实和r突变体果实之间分别发现了分别36 355个CG甲基化，26 257个CHG甲基化和52 002个 CHH甲基化类型的DMR。KEGG通路分析表明，许多DMR与涉及植物激素信号转导，苯丙烷类生物合成，淀粉和蔗糖代谢，碳代谢，氨基酸的生物合成和苯丙氨酸代谢过程的基因有关（附录S8）。还对DMR和DEG进行了分析，并确定了一些DMR和DEG参与了类胡萝卜素途径，例如ZISO，Crtr-b2，LCY，NECD和脱落酸8'-羟化酶1（图5b-d，附录） S8）。此外，研究者还发现了许多DMR和DE mRNA参与乙烯合成和信号传导途径的，例如ACO5，NR，ERF1，ERF2a，ERF 4和ERF119（附录S8）。
研究者联合分析WT和r突变果实之间的DMR与DE lncRNA，结果表明它们的特定变化与乙烯和类胡萝卜素途径有关，例如MSTRG.59396.1（靶标ACO2和ERF7），MSTRG.69293.1（靶标 ERF‐RAP2‐12），MSTRG.162893.1（靶标NSY），MSTRG.116865.5（靶标LCY），MSTRG.95226.7（靶标PSY1），miR172a（靶标AP2‐TOE3），miR5300（靶标ZISO），miR396a‐5p和miR477 ‐3p（靶标EIN3-like）（附录S8）。
图5.r突变体的全基因组DNA甲基化分布与在野生型（WT）和r突变体之间的差异甲基化区域（DMR）和差异表达基因（DEG）。（a）r突变体的全基因组DNA甲基化分布。（b）–（d）WT和r突变果实中15-顺式-β-胡萝卜素异构酶（ZISO，Solyc12g098710.1），β-胡萝卜素羟化酶（Crtr-b2，Solyc03g007960.2）和9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶（NCED，Solyc07g056570.1）的DMR和DEG的比较。
7 WT和r突变果之间代谢产物差异的分析
为了揭示与成熟表型改变相关的全部代谢产物，研究者比较了WT红色成熟果实和r突变果实中所有果皮的代谢产物，鉴定出阳性模式140种代谢产物（与r突变体相比，WT中67上调和73下调），阴性模式中111种代谢产物（与r突变体相比，WT中59上调和52下调）（图6a，b，附录S9）。结合转录组和代谢组分析，分别以阳性和阴性模式鉴定了属于不同KEGG途径的24种和16种不同的代谢物。与r突变体相比，WT中阳性模式中的三种途径的三种代谢物被上调，属于21种途径的21种代谢物被下调，但是，在WT中阴性模式中，来自五个不同途径的五种代谢物被上调，来自11种途径的十一种代谢物被下调。这些差异积累的代谢物被确定参与多种代谢途径，包括氨基酸的生物合成，2-氧代羧酸代谢以及抗坏血酸和藻酸盐代谢。其中的关键途径参与了苯丙烷生物合成和苯丙氨酸代谢，氰基氨基酸代谢和类黄酮生物合成，揭示了它们在番茄果实风味和颜色形成中的特定作用（图6c，d，附录S9）。
图6.红色成熟的野生型（WT; Ailsa Craig，AC）果实与r突变体的果实之间的差异代谢物和KEGG通路网络分析。（a），（b）阳性模式中AC和r突变体之间的差异代谢产物。（c），（d）差异代谢物和DEGs的KEGG通路组合分析（c，苯丙烷生物合成途径；d，氨基酸途径生物合成）。
讨论
成熟的果实是由复杂的调控网络驱动的，但目前对这些成分与其网络的拓扑结构，内部相互作用的了解还远远不够。番茄是研究果实成熟机理的良好模型系统，因为它具有详细的注释基因组和一系列特征明确的单基因突变体。大量的研究揭示了番茄果实软化，颜色变化，与成熟相关的信号转导和下游代谢网络的调控等过程的可能生化变化。为了进一步阐明果实成熟过程中不同调控成分的作用和协同作用，本研究通过深度测序和生物信息学分析，选择了野生果实，Gr和r突变体果实进行多组学比较。将mRNA，非编码RNA信息，基因组甲基化和代谢组学的分析结果与生物信息学分析相结合，可以更完整地了解果实成熟过程中不同水平的关键参与者和协调的调控动态。 WT果实和突变体之间的这些变化和差异性表达表明，DNA甲基化，非编码RNA和影响代谢产物的转录产物之间可能存在协调的调节相互作用，这为进一步研究果实生理学提供了宝贵的研究资源。
DNA的表观遗传修饰在调控基因表达中起着重要作用，在番茄果实成熟期间，果皮组织中整个基因组中的DNA似乎减少了20％至30％。番茄中的DNA甲基化解析揭示了果实发育过程中5-甲基胞嘧啶（5mC）分布的动态变化，并揭示与类胡萝卜素积累（PSY1，ZISO）有关的200多个与成熟相关的基因的启动子中的5mC丢失，果肉质地（PG，PME），乙烯生物合成（ACO1，ACS2）和感知（NR，ETR4）以及许多转录因子，例如RIN，NOR，CNR和TAGL1，它们在成熟过程中起着重要作用。研究者在与果实质地（PAE，PG，PE，PL，β-半乳糖苷酶，β-葡萄糖苷酶）和风味形成（谷氨酸合酶1，类黄酮3'-单加氧酶），色素积聚有关基因（PSY1，DS，ZISO，CRTISO，CCD1A，CCD4，NCED5，ZEP和NSY），乙烯生物合成和信号转导有关基因（ACS2，ACO2，ACO5，MADS-box TF，NR，GR，EIN3，EIN4和ERF TF）相关的三个不同的比较组中鉴定了许多与成熟相关的DMR和DEG。另外，一些带有DMR的DEG显示出特异性表达，例如ERF4，NR和ZISO（靶向12：66127788 | 66128276）在Gr突变体中被下调，而在r突变体中被上调。r突变体中的AP2-ERF-TOE3（以miR172a为靶标）被上调，CrtR-b2（以MSTRG.94590.4为靶标）被上调，MADS-box TF23（以MSTRG.92645.13为靶标）被下调，表明有着在表观遗传水平上类胡萝卜素积累的显著调节变化（图7）。
图7.果实成熟过程中乙烯反应和类胡萝卜素途径调控的调控模型。分析野生型（WT）果实和Gr突变体以及WT和r突变体的差异甲基化区域和差异表达基因，突出了参与乙烯生物合成，信号转导和类胡萝卜素途径的几个关键基因的差异。
番茄成熟过程已显示受几种非编码RNA以及乙烯和其他植物激素的调控。由于高通量测序技术的飞速发展，已经鉴定了成千上万个非编码RNA，但其调控功能尚不清楚，尤其是那些可能参与果实成熟的调控功能。本研究鉴定了数百个与果实成熟有关的非编码RNA（表1，附录S1，S4和S7）。特别令人感兴趣的是MSTRG.17850.2（潜在靶标ERF086），MSTRG.156253.2（靶标CrtR-b1），MSTRG.22786.3和MSTRG.20572.1（靶标果胶酯酶），它们在WT红色成熟阶段果实中特异性表达。MSTRG.172493.3（靶标ACO5），MSTRG.92645.13（靶标MADS-box TF23），MSTRG.183681.1（靶标ERF2-like）和MSTRG.201773.1（靶标果胶酸裂合酶4）等几种非编码RNAs在Gr突变体，表明它们在乙烯合成和信号传导途径以及果实成熟中具有特定功能（附录S1，S3和S5）。有趣的是，许多不同的非编码RNA可能具有相同的靶标，例如MSTRG.59396.1和miR396b（靶标ACO2），miR396a-5p和miR477-3p（靶标EIN3-like），MSTRG.43594.1和miR171b（靶标CTR1-like ），MSTRG.20235.2和unconservative_3_10278（靶标ERF13），MSTRG.107068.2和miR9474-5p（靶标谷氨酸合酶1），MSTRG.86646.1和miR162（靶标PG）。此外，我们构建了一个ceRNA模型，并且许多重要基因如ACO2，MADS-box 23，ERF5，ERF13，ERF021，PG，PL，PE和CesA可能在果实成熟期间受到其协同调控的影响（附录S1，S3和S5）。
已经报道包含集中lncRNA或miRNA的非编码RNA通过指导植物中的DNA甲基化发挥其调节功能。通过DE lncRNA和DMR的组合分析鉴定了差异甲基化的lncRNA编码序列，仅在特定的比较组中发现了几个差异甲基化的lncRNA编码区的变化。例如， MSTRG.156253.2（靶标CrtR-b1），MSTRG.17850.2（靶标ERF086）和MSTRG.26451.1（靶标ERF3-like）仅在WT成熟绿色与红色成熟组中发现；MSTRG.111174.1（靶标ACO5-like），MSTRG.181568.2（靶标ETR2），MSTRG.60188.1（靶标ERF017），MSTRG.111733.1（靶标ERF114）和MSTRG.94590.4（靶标CrtR-b2）仅在WT vs Gr突变组中发现。仅在WT vs r突变组中发现了MSTRG.116865.5（靶标LCY1）和MSTRG.95226.7（靶标PSY1）水平的差异。在WT vs Gr和WT vs r突变组中都发现了许多差异甲基化的lncRNA编码基因，例如MSTRG.59396.1（靶标ACO2和ERF7）。此外，DE miRNA和DMR分析结果还表明了miRNA的重要作用，例如miR171b（靶标CTR1-like），仅在WT与Gr突变组之间存在差异。在WT成熟的绿色vs红色成熟和WT vs Gr的突变体比较中，发现miR9470-3p（靶标ERF5和ERF021）和unconservative_3_10278（靶标ERF13）存在差异，而在WT vs Gr和WT vs r突变体中均发现了miR172a（靶标AP2-ERF-TOE3），miR396a-5p， miR477-3p（EIN3-like）则存在差异。这表明它们在乙烯和类胡萝卜素途径中很重要。
番茄果实的品质取决于生理和生化对理化性质和代谢产物浓度的许多变化。糖，酸和挥发物的动态变化对味道和香气做出了重要贡献，它们共同形成成熟的风味，从而影响消费选择。乙烯和类胡萝卜素途径的人工遗传操控特别受关注，因为这些途径会影响果实成熟和色素积累。 WT和Gr突变体以及WT和r突变体果实的代谢谱和转录组分析结果表明，乙烯反应和类胡萝卜素途径的破坏可能导致氨基酸，类黄酮，苯基丙烷，抗坏血酸和藻酸盐代谢途径的生物合成变化，以及导致果实颜色和风味的变化（附录S3，S6和S9）。
转录组和表观基因组的变化参与了一个复杂而全面的调节网络，该网络调节成熟过程。对ceRNA网络模型的分析显示，在果肉成熟过程中，与miRNA相互作用的lncRNA，circRNA和mRNA可能会发生复杂的相互作用。这项工作中鉴定出的几种非编码RNA，包括ACO2，MADS-box 23，ERF5，ERF13，ERF021，PG，PL，PE，CesA和谷氨酰胺合成酶，潜在具有果实成熟中的关键作用，并构建了一个可能的协调调控网络（附录S1）。本研究为番茄及其他果实成熟研究做出了重要贡献。