科研 | Circ-MALAT1作为mRNA制动器和microRNA海绵，促进肝癌干细胞的自我更新（国人佳作）
编译：Champion，编辑：夏甘草、江舜尧。
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论文ID
原名：Circ-MALAT1 Functions as Both an mRNA T ranslation Brake and a microRNA Sponge to Promote Self-Renewal of Hepatocellular Cancer Stem Cells
译名：Circ-MALAT1作为mRNA制动器和microRNA海绵，促进肝癌干细胞的自我更新
期刊：Advanced Science
IF：15.84
发表时间：2019.12.21
通讯作者：Mao Chunbin&Liu Shanrong
通讯作者单位：美国俄克拉荷马大学&同济大学医学院
DOI号：10.1002/advs.201900949
实验设计
结果
1 Circ-MALAT1在肝细胞CSCs中高表达
为了揭示CSCs和癌细胞之间的circRNA表达差异，研究人员采用circRNA-seq进行分析。首先从患者实体瘤中分离肝癌细胞（HCC）原代细胞，并通过悬浮培养获得CSCs。然后通过CircRNA-seq对CircRNA转录本进行表征。与贴壁细胞相比，193个circRNA转录本在肝细胞CSCs中异常表达（图1A）。在差异表达的环状RNA中，2个在所有CSCs样本中下调，包括circMALAT1在内的18个环状RNA中至少3对发生异位表达（图1B）。
随后，进一步评估了其中9个环状RNA的异位表达。发现环状RNA确实是带有头-尾剪接的结构（图1C）。进一步证实9个候选环状RNA对RNAse R具有抗性，验证环状RNA的环状闭合结构，排除反式剪接和基因组重排的可能性。（图1D），在这9个候选基因中，circ-MALAT1在HCC原代细胞和细胞系中的CSCs表达水平均显著高于匹配的贴壁细胞，因此选择用于进一步研究（图1E）。
2 circ-MALAT1在AUF1的介导下促进了HCC中CSCs的自我更新。
接下来探索肝细胞CSCs中circ-MALAT1生物发生的潜在机制。首先使用了web工具CircInteractome鉴定与circ-MALAT1侧翼区结合的剪接相关因子。分析CSCs和贴壁细胞之间相关蛋白的表达。在前3位候选RNA结合蛋白中，CSCs中AUF1 mRNA表达上调2倍以上，而AGO2和FUS丰度无变化（图2A）。通过蛋白免疫印迹试验，发现肝细胞CSCs中AUF1蛋白表达显著增加。使用AUF1抗体的RNA结合蛋白免疫沉淀（RIP）试验和qRT-PCR分析表明，AUF1蛋白结合pre-circ-MALAT1（图2B）。为了进一步确定AUF1在circ-MALAT1生物发生中的作用，使用小干扰RNA（siRNA）沉默Huh7细胞中的AUF1，发现AUF1敲除显著降低circ-MALAT1的表达（图2C）。为了揭示circ-MALAT1在肝细胞CSCs中的作用，构建了circRNA特异性过表达质粒。此外，选择circ-SPARC作为阴性对照，其在CSCs和贴壁细胞之间无显著差异。用发散引物qRT-PCR证实circ-MALAT1和circ-SPARC的特异性过表达。通过CCK-8实验和EdU成像分析，在Hep3B和Huh7细胞中或circ-SPARC后，未检测到对细胞增殖的明显影响。此外，细胞周期进程或transwell侵袭试验均显示过表达circ-MALAT1或circ-SPARC的Hep3B和Huh7细胞无显著变化。然后建立稳定过表达circRNA的HCC细胞，铺板进行肿瘤球体检测。在功能上，circ-MALAT1过表达的细胞比空对照组形成更多的一级、二级和三级肿瘤球体，而过表达circ-SPARC的细胞与空载体之间未见明显差异（图2D）。接下来，评估了过表达circ-MALAT1的Huh7细胞的异种移植肿瘤的生长。与对照细胞（Vector和circ-SPARC O/E）相比，体内注射circ-MALAT1过表达细胞(circ-MALAT1 O/E)导致肿瘤体积更大（图2E，左图）、肿瘤重量更高（图2E，中图）和肿瘤生长速率更快（图2E，右图）。这些发现表明circ-MALAT1在AUF1的介导下促进了HCC中CSCs的自我更新。
图2 Circ-MALAT1促进肝细胞CSCs的自我更新。（A）RNA结合蛋白AUF1的mRNA在Hep3B CSCs中上调。通过蛋白免疫印迹法分析Hep3B细胞和CSCs中的AUF1蛋白。通过肿瘤球实验富集CSCs。（B）使用Huh7细胞裂解物和抗AUF1或IgG作为IP抗体进行RIP。使用pre-circ-MALAT1特异性引物，通过qRT-PCR分析RIP纯化的RNA。（C）AUF1在Huh7细胞中被两个独立的siRNAs（si-AUF1-1和si-AUF1-2）沉默。沉默Huh7细胞AUF1后circ-MALAT1表达下降。（D）左图，circ-MALAT1过表达(circ-MALAT1 O/E)、circ-SPARC过表达(circ-SPARC O/E)或载体对照(vector)Hep3B细胞球体的明亮图像。右图，每1000个细胞中初级、次级和三级球体数量的定量）统计。比例尺，200µm。（E）稀释Circ-MALAT1过表达（Circ-MALAT1 O/E、Circ-SPARC过表达（Circ-SPARC O/E）和载体对照（vector）Huh7细胞，分别皮下植入5只BALB/c裸鼠。肿瘤接种后14d每3d观察1次肿瘤，为期1个月。
3 circ-MALAT1可以导致肝细胞CSCs中JAK2上调和PAX5下调。
为了了解circ-MALAT1调控肝细胞CSCs自我更新的机制，重点研究了circ-MALAT1相关的下游蛋白。对1358种人抗体进行了基于抗体阵列的分析。用circ-MALAT1质粒或空载体转染Huh7细胞制备蛋白。circMALAT1过表达分别识别224和43个蛋白上调和下调（图3A）。基于GO分析，224个上调蛋白中发现96个与CSCs自我更新或肿瘤转移和增殖相关（图3B，左图）。
在富集倍数最显著的3个GO数据中，选择倍数变化最高的5个蛋白（FGF2、TGFB1、PTK2、JAK2和GH1）作为进一步受试者。此外，43个下调蛋白中的10个参与肿瘤抑制，因此选择用于后续分析（图3B，右图）。然后从circ-MALAT1过表达或空载体的Hep3B细胞中制备蛋白样品，通过western blot分析，验证抗体阵列结果。发现与circ-MALAT1过表达相关的最显著增加的蛋白是Janus活化激酶2（JAK2），这种蛋白，可以诱导CSC样特征（图3C）。相反，在肝癌细胞中10个下调蛋白中的5个蛋白（PAX5、ACTA1、ARFIP1、CLDN5和KRT18）中，circMALAT1过表达后PAX5下降最显著（图3D）。此外，使用特异性siRNA沉默circ-MALAT1（图3E，上图）。与过表达研究一致，circ-MALAT1敲低显著下调JAK2蛋白表达，上调PAX5蛋白表达（图3E，下图）。随后，通过western blot检测了JAK2和PAX5在CSCs和HCC细胞系和原代细胞贴壁细胞中的表达。JAK2在肝细胞CSCs中表达显著上调，而PAX5在CSCs中表达下调（图3F）。而且，circ-MALAT1过表达的Huh7细胞产生的异种移植肿瘤呈现较高的JAK2和较低的PAX5蛋白表达（图3G）。总的来说，这些结果强烈表明circ-MALAT1可以导致肝细胞CSCs中JAK2上调和PAX5下调。
图3 Circ-MALAT1表达导致JAK2和PAX5差异表达。（A）饼图显示，蛋白质微阵列中224个蛋白上调，43个蛋白下调。（B）左图，在上调的224个蛋白中，96个蛋白与CSCs自我更新或肿瘤转移和增殖相关。右图，43个下调蛋白中的10个与肿瘤抑制相关。（C）在转染circ-MALAT1过表达(circ-MALAT1 O/E)或空载体(vector)的Hep3B细胞中，通过western blot分析抗体阵列结果中的5个上调蛋白。（D）通过western blot分析，在circ-MALAT1过表达（circ-MALAT1 O/E）或空载体（vector）细胞中分析了来自抗体阵列结果的5个下调蛋白。（E）circ-MALAT1沉默的Hep3B细胞中通过western blot检测JAK2和PAX5的蛋白表达。（F）western blot检测2株HCC细胞株（左图）Hep3B和Huh7及2株HCC原代细胞（右图）CSCs和贴壁细胞JAK2和PAX5的表达。通过肿瘤球实验富集CSCs。（G）通过蛋白免疫印迹法测定异种移植瘤中JAK2和PAX5的表达。
4 Circ-MALAT1通过与PAX5编码序列和核糖体结合，阻碍PAX5翻译
已报道的研究仅显示circRNA上调蛋白表达。我们发现circ-MALAT1过表达下调了PAX5蛋白的表达，这与之前的观点相反。为了解释发现的下调机制，首先进行了荧光原位杂交，发现circ-MALAT1 circ-MALAT1只定位于细胞质而不是细胞核（图4A）。然后通过qRT-PCR检测circ-MALAT1过表达后PAX5 mRNA的表达。令人惊讶的是，circ-MALAT1过表达未见明显变化（图4B），这表明circ-MALAT1可能在转录后水平对PAX5发挥其调节作用。进一步分析，在circ-MALAT1序列中观察到两个IRESs，提示circ-MALAT1与核糖体的潜在结合能力。然而，在circ-MALAT1中没有发现开放阅读框（ORF），这意味着circMALAT1没有呈现编码能力。同时，我们通过NCBI Blast发现circ-MALAT1中有11个碱基（557-567）与PAX5编码序列互补。基于这些分析，我们假设circ-MALAT1可能通过分别通过IRESs和11个互补碱基与PAX5和核糖体形成三元复合物来阻碍PAX5的翻译（图4C）。
为了验证该模型，使用circMALAT1过表达的Huh7细胞裂解物进行RIP试验。首先，通过蛋白免疫印迹法确认RPS6抗体。与对照IgG相比，抗RPS6 RIP的PCR产物中circ-MALAT1增加约12倍，PAX5增加约40倍。而MALAT1组未发现显著差异（图4D，左图），表明circMALAT1和PAX5均可与核糖体结合。接下来，构建了两个circ-MALAT1突变质粒，circMALAT1的640-762位(IRES1)或611-755位(IRES2)分别被非IRES部分取代。裂解转染circ-MALAT1 IRES突变质粒的Huh7细胞进行RIP检测。circ-MALAT1 IRES2突变样本的抗RPS6 RIP产物与IgG对照相比，数量增加2-3倍，而IRES1突变无差异（图4D，中图），表明circ-MALAT1与核糖体结合需要IRES1和IRES2的共有序列（640-755位）。
为了找出肝癌细胞中PAX5和circMALAT1之间的相互作用，通过体内circMALAT1 pull-down实验，在纯化的circ-MALAT1相关RNA中通过qRT-PCR检测PAX5 mRNA。发现与对照组相比，circ-MALAT1特异性探针显著富集circ-MALAT1以及PAX5 mRNA。同时，在转染circ-MALAT1的Huh7细胞中，也用生物素标记的PAX5 mRNA特异性探针进行了体内RNA pull-down实验，无论是野生型（WT）还是缺失9个碱基的突变体，这些碱基与PAX5编码序列互补。我们发现，与对照组相比，Huh7样本中circMALAT1 WT和11 bp MUT过表达的PAX5 mRNA特异性富集水平相当（图4E，左图）。然而，突变样本中circ-MALAT1的富集倍数（约5倍）远低于WT（图4E，中图），这表明11个碱基对于circ-MALAT1结合PAX5 mRNA具有重要意义（图4E，右图）。然后检测候选靶蛋白的表达。Western blot显示circ-MALAT1过表达细胞中PAX5蛋白及其下游蛋白p53下调（图4F）。同时，PAX5和p53也被证实在CSCs中下调（图4G）。然而，当突变circMALAT1上的11个互补碱基或IRES1时，在circ-MALAT1突变的过表达细胞中未观察到PAX5蛋白的显著降低（图4H）。只有转染WT circ-MALAT1的细胞呈现PAX5蛋白的显著下调，但转染circ-MALAT1 IRES2突变体的细胞表现出PAX5蛋白的轻微下调（图4H）。接下来，通过RNA干扰，沉默了Huh7细胞中的circ-MALAT1或/和PAX5。数据显示，沉默circ-MALAT1可增强PAX5和随后p53的蛋白水平，而PAX5敲低可抑制该增强。总之，上述结果表明circ-MALAT1通过IRESs竞争性结合核糖体，从而抑制PAX5翻译。
图4. Circ-MALAT1通过与PAX5编码序列和核糖体结合，阻碍PAX5翻译。（A）circ-MALAT1的RNA荧光原位杂交。细胞核用DAPI染色。针对circ-MALAT1的绿色染色信号定位于细胞质。（B）qRT-PCR分析PAX5 mRNA的水平。与对照(Vector)相比，Circ-MALAT1过表达(Circ-MALAT1 O/E)导致PAX5 mRNA水平无显著差异。（C）一个相互作用模型显示circ-MALAT1通过11bp碱基配对（红色位点）识别PAX5 mRNA，并通过IRESs（黄色位点）竞争性抑制PAX5翻译。（D）左图，使用正常兔IgG或抗RPS6抗体对circ-MALAT1过表达的Huh7细胞制备的RIP裂解物进行免疫沉淀。（D）显示突变IRES(MUT)的circ-MALAT1不能与核糖体结合。（E）在circ-MALAT1 WT或11 bp MUT过表达的Huh7细胞中使用PAX5特异性探针进行体内RNA pull-down，然后进行qRT-PCR检测PAX5（左图）和circ-MALAT1（中图）。（F）western blot检测PAX5及其下游蛋白p53。（G）western blot分析Hep3B细胞株CSCs和贴壁细胞中PAX5和p53。通过肿瘤球实验富集CSCs。（H）western blot检测过表达circ-MALAT1野生型（WT O/E）或突变型（11 bp MUT O/E、IRES1 MUT O/E和IRES2 MUT O/E）或无（Vector）的Huh7细胞中PAX5。
5 Circ-MALAT1作为miR-6887-3p海绵上调JAK2。
由于在肝脏CSCs中随着circ-MALAT1的上调观察到JAK2增加，并且已知circRNA作为microRNA海绵上调靶基因表达，随后使用MiRanda程序预测circ-MALAT1序列上的miRNA结合位点。生物信息学分析表明，有322个潜在的miRNA可以被circ-MALAT1结合。还鉴定了可能靶向JAK2的miRNA。通过重叠两组miRNA，筛选出121个预测的miRNA，因为它们与circ-MALAT1有结合位点，并可能靶向JAK2。然后分析miRNA与circ-MALAT1结合自由能最高的前5位miRNA。随着circ-MALAT1过表达，miR-6887-3p表达大大降低而miR-214-3p、miR-676-5p、miR-503-5p和miR-4773的表达未表现出明显变化（图5A）。进一步详细分析显示，circ-MALAT1含有8个保守的miR-6887-3p种子匹配。体内circ-MALAT1 pull-down实验表明，与对照组相比，circ-MALAT1特异性探针可以高效地下拉circ-MALAT1（图5B，左图），miR-6887-3p也显著富集（图5B，右图）。这一结果提示miR-6887-3p是HCC细胞中circ-MALAT1相关的miRNA。
接下来评估JAK2是否是miR-6887-3p的靶标。JAK2编码的mRNA含有一个3’-非翻译区（3’UTR）元件，与miR-6887-3p部分互补，表明miR-6887-3p会直接靶向该位点。在mRNA和蛋白水平检测转染或未转染miR-6887-3p模拟物或抑制剂的Huh7细胞中JAK2的表达。如图5C所示，用miR-6887-3p模拟物处理后，JAK2 mRNA没有受到显著影响（上图），但JAK2蛋白显著下降（下图）。相反，miR-6887-3p抑制剂处理后JAK2表达表现出相反的趋势（图5D）。这一发现表明miR-6887-3p可以在转录后水平抑制JAK2表达。为了证实这一发现，将含有野生型和突变型假定miR-6887-3p结合位点的JAK2 mRNA的3’-UTR插入荧光素酶报告载体中，分别生成pMIR-JAK2-3'UTR-WT和pMIR-JAK2-3'UTR-MUT。pMIR-JAK2-3'UTRWT的荧光素酶活性可以被miR-6887-3p模拟物有效抑制（图5E，上图），并被其抑制剂增强（图5E，下图），而当结合位点发生突变时，没有观察到明显的变化。然后Western blot证实在Hep3B细胞系中过表达circ-MALAT1后JAK2/STAT3信号通路中关键蛋白分子的表达发生变化。过表达circMALAT1可减弱miR-6887-3p对JAK2的抑制作用，从而增加JAK2的总蛋白水平，增强其磷酸化水平（图5F）。进一步促进STAT3的磷酸化和活化（图5E）。然而，STAT3的总蛋白水平无显著变化（图5F）。此外，还证实JAK2/STAT3信号通路中的3个关键蛋白分子JAK2、磷酸化JAK（2p-JAK2）和磷酸化STAT3（p-STAT3）在CSCs中上调（图5G）。
图5 Circ-MALAT1作为miR-6887-3p海绵上调JAK2。（A）通过qRT-PCR分析过表达circ-MALAT19（circ-MALAT1 O/E）或空载体（vector）Huh7细胞中结合自由能最高的前5位miRNA。（B）在过表达circ-MALAT1的Huh7细胞中使用circ-MALAT1特异性探针进行体内circ-MALAT1 pull-down，然后进行qRT-PCR检测circ-MALAT1（左图）和miR-6887-3p（右图）。（C）用miR-6887-3p mimic或其乱序版本处理后，qRT-PCR检测miR6887-3p水平和mRNA处JAK2表达（上图），western blot检测蛋白水平JAK2表达（下图）。（D）用miR-6887-3p抑制剂或其乱序版本（对照抑制剂）处理后，qRT-PCR检测miR-6887-3p和JAK2 mRNA的水平（上图），western blot检测蛋白水平的JAK2表达（下图）。使用U6和GAPDH作为对照引物。（E）当细胞与miR-6887-3p mimic（上图）或miR-6887-3p inhibitor（下图）共转染时，检测pMIR-JAK2-3’UTR野生型（WT）和突变型（MUT）的荧光素酶活性。（F）通过western blot分析circ-MALAT1过表达（circ-MALAT1 O/E）或空载体（vector）细胞中JAK2/STAT3通路的关键分子。（G）western blot分析Hep3B细胞系CSCs和贴壁细胞中JAK2/STAT3信号通路中的关键蛋白分子。
6 Circ-MALAT1在体内吸收miR-6887-3p上调JAK2。
为了进一步验证miR-6887-3p在体内的特异性，分析了用miR-6887-3p模拟物或抑制剂处理后异种移植肿瘤中JAK2的表达。用miRNA模拟物处理后，JAK2 mRNA和circ-MALAT1没有受到显著影响（图6A，上图），但用miR-6887-3p模拟物处理后，JAK2蛋白显著下降（图6A，下图）。相反，用miR-6887-3p抑制剂处理的肿瘤中JAK2表达表现出相反的趋势（图6B）。此外，由于MALAT1减弱了miR-6887-3p对JAK2蛋白的抑制作用（图6C），体内p-JAK2增强（图6D）。总之，上调CSCs中的circ-MALAT1可以吸收miR-6887-3p，从而增强JAK2/STAT3通路活性，用于肝细胞CSCs的自我更新。
图6 Circ-MALAT1在体内吸收miR-6887-3p上调JAK2。（A）用miR-6887-3p mimic、miR-512-5p mimic或其乱序版本（control mimic）处理后，qRT-PCR法（上图）检测移植瘤的circ-MALAT1和JAK2 mRNA，western blot法（下图）检测蛋白水平的JAK2表达。（B）经miR-6887-3p抑制剂、miR-512-5p抑制剂或其乱序版本（对照抑制剂）处理后，qRT-PCR检测移植瘤的circ-MALAT1和JAK2 mRNA（上图），western blot检测蛋白水平JAK2表达（下图）。（C）在circ-MALAT1过表达(circ-MALAT1 O/E)或空载体（vector）Huh7细胞产生的异种移植肿瘤中分析miR-6887-3p表达。（D）在circ-MALAT1过表达（circ-MALAT1 O/E）或空载体（vector）Huh7细胞生成的异种移植肿瘤中测定p-JAK2。
讨论
本研究结果显示了circRNA的一种新的双面调控途径（图7）。一方面，circ-MALAT1通过miR-6887-3p上调癌基因JAK2，增加磷酸化的JAK2，增强JAK2/STAT3信号，促进肝脏CSCs自我更新。另一方面，重要的是，本研究发现了一种新的mRNA制动机制，其中circRNA分子作为刹车，通过同时结合核糖体和PAX5 mRNA直接抑制PAX5 mRNA翻译。circMALAT1不仅结合核糖体，还结合PAX5 mRNA的编码序列，形成特异性的三元复合物。三元复合物使circ-MALAT1像刹车一样镶嵌在PAX5编码序列和核糖体之间，直接阻碍PAX5 mRNA的翻译，影响PAX5相关的细胞功能。研究人员认为mRNA刹车，通过形成前所未有的三元复合物ribosomecirc-MALAT1-PAX5 mRNA，是circRNA在生理和病理条件下的一种新型调控模式。
图7 Circ-MALAT1作为mRNA制动器和microRNA海绵，促进肝癌干细胞自我更新的机制示意图。
评论
本研究通过环状RNA测序(circRNA-seq)数据，比较了HCC细胞系和HCC原代细胞的匹配CSCs和贴壁细胞中的环状RNA表达，并检测了一些在CSCs中差异表达的环状RNA，发现circ-MALAT1通过带有两个特异性结合位点，与抑癌基因PAX5的核糖体和mRNA形成复合物。由此产生的的三元复合物延缓PAX5 mRNA翻译，并最终有助于CSCs的维持。同时发现Circ-MALAT1通过作为miR-6887-3p海绵增强JAK2表达，激活JAK2/STAT3信号通路促进CSC自我更新。
本研究发现了非编码RNA负调控编码基因翻译的一种新模式，揭示了环状RNA介导的转录后调控的双面模式，最终维持细胞的特定状态。进一步深入研究现的环状RNA的mRNA制动机制，有望为揭示环状RNA在调节生命活动中的作用揭开新篇章。
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