Microbiome：16s分析的价格，宏基因分析的结果，这个你可以有！
俄亥俄州立大学Ann L. Griffen等人于2018年9月5日在《Microbiome》发表了题目为《High-resolution ISR amplicon sequencing reveals personalized oral microbiome》的文章。该研究表明16-23S基因间隔区（intergenic spacer region ，ISR）扩增子测序方法具有高通量，高分辨率和低成本的优点，并且可以更好的分析复杂的口腔微生物结构。
研究摘要
16S rRNA基因的测序已成为研究微生物群落组成的标准。虽然在种水平上它也可以识别，但这种方法通常不能提供完全的亚种水平的菌群信息。种水平的分辨率不足以探索与疾病相关的亚种的变化。使用宏基因组鸟枪测序进行菌群分析具有明显的局限性，这使得它不适合大规模研究。若想实现足够的测序深度可能成本过高，即使有足够的覆盖率，对口腔微生物群这种复杂的菌群群落也是非常具有挑战性的。因此，分析微生物群落的低成本，高分辨率的高通量方法是很需要的。
通过将多样性丰富的标记基因，核糖体16-23S基因间隔区（intergenic spacer region ，ISR）的扩增子测序与基于概率误差建模的去噪算法DADA2相结合，即可改善基于扩增子的细菌群落分析。
通过分析龈下菌斑样本来比较这种新方法及标准的16S测序方法的分辨率。与标准和高分辨率的16S rRNA基因分析相比，ISR方法使菌群分辨率提高了5.2倍，并且在预测临床样本的正确来源方面显示出100％的准确性。
个体的微生物群落是高度个性化的，尽管菌群组成随着时间的推移会发生一些变化，但这种变化远远小于两个个体之间的差异。甚至是1年的菌群的变化都小于两个个体之间的差异。
从公开可用的基因组序列构建ISR数据库使我们能够探索种水平上的基因组的变化，从而可鉴定大多数菌种ISR的多种变化。
ISR方法显著提高了菌群分析的分辨率，并揭示了一种高度个性化的人口腔微生物群，其稳定性超过1年。在检查到的所有菌种中发现有多种ISR类型，表明口腔微生物群中亚种的高度变异。该方法低成本，其成本与16S rRNA基因扩增子测序相当。并具有高通量和高分辨率，可允许亚种水平的识别。它对于鉴定生物需要高分辨率的一系列应用是有用的，包括微生物追踪，菌群指纹识别，以及可能用于鉴定毒力相关菌株。
文中主要图片说明
图1 同16S V1-V3相比，16-23S 基因间隔区（ISR）分析口腔链球菌的多样性更高。左图：口腔链球菌属的16S V1-V3区分析的比对。有限的变异使得难以使用16S rRNA基因测序来区分口腔链球菌。右：同一链球菌属的ISR序列的比对。从大的间隙区域可以看出，其中最突出的保守区域是丙氨酸tRNA基因。
图2 本研究的PCR扩增，测序和生物信息处理流程示意图。用经验证的通用引物分别扩增16S V1-V3和16S V8-V9-ISR区域。使用具有2x300bp配对末端化学的Illumina MiSeq对扩增子进行测序。如图所示，在三种不同的生物信息管道中处理序列读数，并比较菌群组成以评估每个管道的性能。ISR读数也用于亚种水平的菌群结构分析。
图3 ISR管道提供了微生物群落的最高分辨率。A：每个管道生成的序列变体的数量。B：每个管道分别确定个体特有的序列变体的百分比。C：每个管道分别确定五个个体共享的序列变体的百分比。D：箱形图显示样品之间的分离程度或样品分辨率。
图4 基于距离的菌群分析证明高分辨率ISR管道数据揭示了所有受试者的个性化微生物情况。上图：从左到右，基于Bray-Curtis相异度矩阵的非度量多维缩放（NMDS）图显示了三种方法：16S参考数据库，16S高分辨率和ISR高分辨率。显示了五个受试者及六个时间点。下图：从左到右，显示了基于相关距离的分层聚类树状图，用于三种方法。
图5 口腔微生物群的稳定性超过1年。对于16S参考数据库（左），16S高分辨率（中间）和ISR高分辨率（右）方法，显示了每个受试者口腔微生物随时间产生的Bray-Curtis距离差异。
图6 三种丰富口腔细菌的种群结构。A：对于每个菌种，显示整个数据集的相对丰度的条形图。ISR类型按丰度减少的顺序排列和标记，并且在下图中使用相同的顺序。B：在任意时间点，每个菌种存在个体中的百分比。C：使用热图显示每个菌种随时间检测的频率。
图7 ISR类型的相对丰度随时间波动。对于每个受试者，H. parainfluenzae, Granulicatella adiacens, 和the Streptococcus mitis group的相对丰度以堆积条形图显示。ISR类型的编号如图6所示，基于它们的总体丰度，并且仅显示了最丰富的25种。
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