科研 | ISME：利用宏基因组学探究美洲河狸粪便微生物（第七期投票选出的文章）
本文由殷继忠编译，董小橙、江舜尧编辑。
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美洲河狸可以通过筑坝改变景观并塑造生物多样性。虽然河狸可以使用木本植物作为建筑材料和膳食主食，但是对于其胃肠道中的微生物及其在确定宿主中的功能作用仍知之甚少。在这里，作者使用宏基因组学、功能筛选和生物化学方法来分析其粪便微生物的群落结构与代谢能力，并进一步分析了分布在群体中的基因组与糖苷水解酶（GH）信息。
论文ID
原名：Metagenomics reveals functional synergy and novel polysaccharide utilization loci in the Castor canadensis fecal microbiome
译名：宏基因组学揭示了北美河狸粪便微生物的功能协同作用和新型多糖利用位点
期刊：The ISME Journal
IF：9.52
发表时间：2018年
通信作者：Zachary Armstrong
通信作者单位：哥伦比亚大学
实验框架
实验设计图
实验内容
为了分析河狸粪便的微生物群落组成，作者对捕获的2只河狸的复合粪便样品进行测序。在确定的OTU中，只有两个不能与Silva数据库中的同源性微生物序列相关联[20]（图1）。结果发现厚壁菌和拟杆菌为优势菌种，在其他野生啮齿动物中也可以看到厚壁菌和拟杆菌的相同情况[24,25]。作者使用鸟枪宏基因组测序技术预测河狸微生物组编码的代谢功能。结果发现从宏基因组中回收的小亚基核糖体rRNA（SSU rRNA）基因与厚壁菌或拟杆菌有关，与pyrotag测序结果一致（图1）。
图1 河狸粪便微生物群落组成
鉴于河狸粪便微生物和其后肠发酵组成的相似性，作者开始将重点集中在碳水化合物活性酶(CAZymes)。CAZymes能够形成不同的簇，其中编码纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶的糖苷水解酶（GH）部分在食草动物中的比例较高，而编码糖胺聚糖酶的在食肉动物中的比例过高，该结果与先前的报道一致。海狸粪便微生物和其他后肠发酵的食草动物中存在的CAZymes和KEGG途径之间的功能相似性。
通过研究鉴定出群体基因组区室内丰富的GH家族。所有中等质量部分都表现出与木质纤维素生物质解构有关的不完全酶谱，与底物转化过程表现一致。样本中包含编码半纤维素降解酶的多种基因，平均占所有开放阅读框（ORF）的2.1％，但缺乏编码葡糖醛酸脱支酶基因（GH家族的67和115）。剩余部分似乎具有较低的木质纤维素生物质降解能力，但却含有多种淀粉或糖原降解酶以及由共存微生物内切酶释放的简单葡萄糖苷和寡糖。
虽然得到了关于微生物群落代谢潜力的具体信息，但仅限于序列同源性推断出的特定CAZyme功能。为了更好地验证基因模型，作者通过功能筛选回收了活性CAZymes。结果发现在这些质粒上编码的活性酶具有广泛的底物特异性。
为了鉴定介导底物转化的基因情况，作者对51个活性克隆进行测序。使用ABySS汇编读数，根据插入长度的相似度进行序列比较鉴定出38个非冗余克隆[28]。通过针对CAZy数据库测序鉴定了来自28个GH家族的135个GH基因（图2b）。回收的GH家族中最丰富的是GH3，它含有β-木糖苷酶和β-葡萄糖苷酶，GH43则含有β-木糖苷酶和木聚糖酶[47]。在未组装的宏基因组中，鉴定了来自23个亚族的115个GH43基因，发现其在哺乳动物基因组中有极高的多样性。在活性克隆上鉴定了来自10个亚族的总共27个GH43基因（表1）。在相同蛋白质内存在的糖苷酶结构域可致使多糖有效解构并产生协调作用。
图2 从高通量结果中筛选鉴定出质粒
表1 在功能活性质粒上鉴定GH43亚族
为了更好地了解酶的底物特异性和活性，作者将注意力集中在通过功能筛选鉴定的未表征GH43亚族上。创建了用于过表达和纯化重组蛋白的构建载体，其中GH8和GH43结构域通过催化酸残基的突变而失活。12_H03-13和12_J03-18均切割CMU-木糖苷，其中在相同误差范围内的12_H03-13野生型酶的特异性常数与GH8中活性减弱的H03_E507A变体相同（表2），表明GH43结构域负责木糖苷酶活性。
表2 测定纯化GH43的酶动力学参数
还在一组阿拉伯木聚糖寡糖上测试了酶12_H03-12、12_H03-13及其突变体的活性。12_H03-13的GH43结构域从寡糖的非还原末端释放未修饰的木糖，而12_H03-13的GH8结构域从修饰的寡糖的还原末端释放木糖（图3）。预期12_H03-13的GH43结构域会进一步降解木二糖，但事实并非如此，表明阿拉伯糖侧链的存在对该结构域的木糖苷酶活性可能会产生影响。结果阐明河狸粪便微生物背景下GH43亚族2、7和28的底物特异性与活性，其与木质纤维素的生物质转化和宿主营养具有直接联系。
图3 在fosmid测序上鉴定属于GH43亚族2和7的活性
除了提供预测GH基因的功能验证途径之外，活性克隆序列还包含关于GH基因的组织结构信息。这揭示了几个GH基因簇与植物细胞壁半纤维素的联系（图4a）。
图4 预测半纤维素靶向fosmids和SusC / SusD编码质粒的基因
此外，作者分析fosmids测序结果后发现有15个含有Sus样基因（SusC或SusD），通过使用自动预测工具来鉴定多糖利用位点（PUL）（图4）[53]。其中的8个表现出接近完全的核苷酸同一性，四个在PUL间隔中特异性地共享完全核苷酸同一性。
总之，在fosmids上鉴定的PUL和基因簇似乎靶向植物细胞壁的许多半纤维素组分。然而，这些基因作用的一些聚合物可能不存在于硬木中。当食物稀缺时，河狸可以通过降解这些聚合物的能力支撑营养摄入。
实验结论
目前的研究打开了探究河狸粪便微生物功能的宏基因组窗口，将木本植物解构成可溶性糖来支持宿主营养。双结构域酶的存在赋予了海狸粪便微生物的协同能力，有效降解半纤维素内存在的特定连接。这不仅释放出单糖，而且半纤维素支架的降解也使得下面的纤维素容易消化提高了转化效率。
评 论
作者的解构原则可以反过来用于设计增强生物催化剂，提高现代生物精炼生态系统中木聚糖的输入。同时这些结果为我们提供了模块化领域结构和功能专业化的独特视角，便于后人进一步探究。评价仅属小编的个人看法，欢迎大家一起讨论。感谢大家多提意见，提携小编进步。
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参考文献
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