科研 | 土壤COS和CO18O转换率随微生物群落及其碳酸酐酶的多样性而不同 / 四六文摘

本文由郭修诚编译，董小橙、江舜尧编辑。

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导读

分光合作用和呼吸作用对全球碳循环的具体贡献对于改进预测气候模型至关重要。植物叶片中的碳酸酐酶（CA）是羰基硫化物（COS）和二氧化碳-18同位素（CO¹⁸O）成为生物圈-大气圈中最大痕量气体通量的主要因素，它们反映了总的光合速率。然而，CA活动也发生在土壤中，且在使用COS和CO¹⁸O作为碳循环示踪物时会成为不确定性的来源，直到基于过程的约束得以改进。

在该研究中，作者测定了COS和CO¹⁸O的转换率，并从一系列微生物群落和土地利用类型中估算了土壤中相应的CA活性。结果显示，土壤CA活性在COS和CO₂的转换过程是不一致的，其差异与微生物群落组成和CA基因表达模式有关。在某些情况下，相同的微生物菌群和CA酶类催化了土壤中的COS和CO₂反应，但在另一些情况下，两种反应底物的特异性显著不同。COS过程中CA活性与真菌种类和β-D-CA表达有关，而CO₂的CA活性与藻类和细菌种类以及α-CA表达有关。

本研究整合了气体交换测量、酶活性模型、土壤分类学和遗传多样性的特征，以建立CA活性与土壤微生物种群之间的联系。重要的是，该研究结果确定了动力学参数，可以用来表示以COS和CO¹⁸O作为碳循环示踪剂时土壤CA的活性。

论文ID

原名：Soil exchange rates of COS and CO¹⁸O differ with the diversity of microbial communities and their carbonic anhydrase enzymes

译名：土壤COS和CO¹⁸O转换率随微生物群落及其碳酸酐酶的多样性而不同

期刊：The ISME Journal

IF：9.52

发表时间：2018.9.13

通信作者：Laura K. Meredith

通信作者单位：斯坦福大学地球系统科学系，加利福尼亚州，美国

背景

COS和CO¹⁸O作为大气示踪物，用于将陆地上CO₂的净交换细分成呼吸和光合两个部分，这对于预测气候-碳反馈机制及对陆地上大量碳储存的影响至关重要。能够作为示踪剂的基础是它们与叶片中的碳酸酐酶(CAs)的反应，该酶通过催化二氧化碳(CO₂+H₂OHCO₃^-+H⁺)的可逆水合促进光合作用固碳。CAs不仅仅限于植物，而且存在于土壤的微生物中。在叶片和土壤中，CAs驱动COS消耗以及CO₂-H₂O同位素平衡，并且这类酶活动可以影响大气组成模式从而来限制陆地光合作用。具体而言，在CO₂水合过程中，CO₂与叶和土壤中的水分子(CO₂+H₂¹⁸OCO¹⁸O+H₂O)之间交换氧同位素，从而影响大气中CO¹⁸O的浓度。因此，大气CO¹⁸O的变化反映了CO₂与叶片和土壤中的水相互作用的程度，CO¹⁸O还可用在大尺度上示踪陆地光合作用和土壤呼吸。CA_S也催化了COS在叶片和土壤中的不可逆水解反应（COS+H₂OCO₂+H₂S）。由于在生长季节，陆地生物圈对COS的吸收主要由光合作用吸收所主导，大气COS浓度的波动也可以作为陆地光合作用的示踪物，而不是仅仅依赖CO¹⁸O。

COS和CO¹⁸O的土壤转换率很高，其变异性的驱动因素尚不清楚。已观察到土壤中的生物活性加速大气CO₂和土壤水之间的氧同位素交换，比未催化的CO₂水合速率高10至1000倍，并在各种生态系统中驱动COS的显著吸收。土壤COS和CO¹⁸O的交换与土壤CA活性随时空不同而变化，这给大气CO¹⁸O和COS的反转期去估计初级生产力引入了不确定性。需要我们对COS和CO¹⁸O的土壤CA活性进行系统研究，以确定生态和环境因素如何影响土壤交换率。

了解驱动土壤CA活性的COS和CO₂的关键微生物类群和CA酶的多样性，能够来提高对机理的理解和模型展示。CA是一类广泛分布的酶，包括六种已知类别（α，β，γ，δ，ζ，η）。生物体通常包含来自多个类别的CA基因或来自同一类别的编码CA的多个基因。CA存在于自养和异养微生物中，并参与C固定，pH调节和硫元素代谢。已经在古细菌，细菌，真菌，藻类，植物和动物中证实了CO₂的CA活性，并且已经在细菌和真菌中发现有COS消耗。最近的研究发现，藻类丰度与土壤CO₂-H₂O同位素交换率相关，而真菌丰度与土壤COS消耗率相关，如与暴露于杀菌剂的土壤中COS消耗量的减少一致。因此，虽然CA在土壤微生物中显然很普遍存在，但COS和CO₂的活动可能主要由特定的微生物类群或CA类驱动。

在这里，我们报道了从不同生物群落和土地利用收集的土壤中的COS和CO¹⁸O转换率，包括我们预期可能会影响土壤微生物组的一系列土壤和环境因素。我们的方法是测量在受控条件下与环境波动隔离的实验室培养中的气体交换率，以表征驱动CA活性的土壤和微生物特性。我们的零假设是土壤CA活性会随着土壤微生物群落结构的变化而变化，因为CA类的相对丰度和表达图谱存在响应差异。我们分析了土壤理化性质，微生物群落组成和CA基因表达谱，并与源自CO₂和COS痕量气体测量的土壤CA活性建立稳固的关系。我们的研究填充了驱动土壤CA活性的核心微生物群落和CA酶类的知识空白，并为展示土壤对大气COS和CO¹⁸O影响的模型提供新的约束条件。

实验内容

1 土壤COS和CO¹⁸O的转换率随土壤生物和土地利用方式不同而不同

在包含一系列生物群落和土地利用历史的20个地点（表S1），通过土壤微宇宙法测量了COS的净交换和与土壤水（f_eq）达到同位素平衡的CO₂部分。生物群落和土地利用影响净COS和CO₂-H₂O氧同位素交换的速率（图1彩色柱和点;表S2），这些在森林中通常最高，在地中海气候生态系统和沙漠中较低。来自农业用地的土壤中的净转换率最低且变化最大（图1中的交叉圆圈）。净COS交换能够表示COS的酶消耗和假定的非生物COS产生之间的平衡。我们通过测量生物COS消耗受空气干燥限制的土壤的COS排放来估算COS生产率。所有空气干燥的土壤都发出COS，除了来自沙漠的土壤（图1a，上部白色柱），并且在农业土壤中测量的排放量最高。区分COS消耗率的分区（图1a，下部白色柱）显示，与其他生态系统相比，由于高COS产量和低COS消耗率，农业土壤的净COS交换量较低。

图1 土壤COS和CO¹⁸O的转换率的变化

2 COS和CO¹⁸O的土壤CA活性随生物群落和土地利用不同

我们使用土壤COS消耗和CO₂-H₂O同位素平衡来使用痕量气体模型得出两种底物的酶催化速率，该模型描述了土壤基质中COS和CO¹⁸O的产生，扩散和一级消耗反应。CO₂水合过程中CO₂-H₂O同位素交换的一级土壤反应速率（k_CO2;s^-1）和COS水解（k_COS; s^-1）相关（图S1b; r = 0.55，p <0.001），用COS消耗量和f_eq来表示（图S1a; r = 0.67，p <0.001）。这表明非生物过程（即扩散限制和未催化的反应速率）不是COS消耗和CO₂水合趋势的主要驱动因素（图1）。相反，生物过程是主要驱动因素，酶催化反应速率大于未催化反应速率（表1）。虽然CO₂的绝对反应速率大于COS，但生物催化（f_CA）的相对增强对COS来说要高2-3个数量级（表1）。催化反应速率随生物群和土地利用而变化，根据包括气候变量在内的许多因素来区分场地的名称（图S2）。COS/CO2催化反应速率(k_COS/k_CO2)的比例随生物群落和土地利用而变化，在森林和草原热带土壤（0.77-0.84），在地中海（主要是附近具有橡树灌丛林地的草原）和沙漠生物群落中间最高（0.30-0.42），农业土壤中最低（0.20）（表1和S2）。COS和CO₂的CA活性没有持续变化，它们的差异主要由k_COS的变异性驱动（表1）。如果不同的分类群或CA类在土壤中占据主导地位，则COS和CO₂的催化反应速率会出现差异。

表1 COS和CO₂的生物组平均值和CA反应速率（k）和增强因子（f_CA）的SD

3 土壤理化性质和微生物类群作为CA活性的指示器

我们测定了土壤细菌和古细菌（16S rRNA基因扩增子测序）以及真核微生物，包括真菌，藻类和原生动物（ITS2扩增子测序）（图S3），并计算了丰富度和多样性指标。在测量的土壤性质中（表S3-S5），微生物多样性随土壤C/N变化最强（与细菌/古细菌和真核微生物的相关性分别为r = 0.44，p <0.001和r = 0.53，p <0.001）。与之前的一些研究一样，细菌和古菌群落的多样性随土壤pH值的增加而增加（r = 0.62，p <0.001），但不包括沙漠（高pH值，低多样性）。土壤微生物群落通常由生物群落聚集而成，群落结构差异与土壤pH，结构，养分和微生物多样性的差异一致（图2）。来自农业土壤的微生物群落（图2交叉的圆圈）和其他对COS和CO₂具有不同CA活性的土壤（图2由开放圆圈和闭合圆圈之间的白色空间表示）更加明显。

图2 土壤微生物群落聚集并与土壤pH，粘土分数，碳和多样性相一致。

我们使用偏最小二乘法（PLS）回归来评估25理化性质和生态因子来预测CA活性及其对COS和CO₂差异的能力。多变量模型分别解释了k_COS，k_CO2及其比率（k_COS/ k_CO2）的变异的85％，42％和79％（图S4a-c）。CA活动的主要预测因子是结构（土壤容重和质地）和土壤化学性质（例如，碳，氮，磷），与先前的研究一致，显示土壤CA活性与土壤有机质，总氮和C/N比具有相关性。COS和CO₂的CA活性差异程度较低的土壤(k_COS/k_CO2较大)与土壤碳氮含量较高、质地较粗、容重较低、微真核生物丰富度和多样性较高、细菌和古生菌丰富度和多样性较低有关。（图S4a-c和表S5)因此，COS的CA活性可能对土壤养分水平和土壤结构的变化特别敏感。我们的农业土壤粘土含量相对较高，微生物生物量，碳和氮含量较低（图S5和表S3-S5）。农业土壤模型解释的总方差小于非农业土壤模型（68％对比k_COS/ k_CO2的83％; 56％对k_COS的90％），k_CO2除外（农业为57％;与非农业土壤无显著差异）并确定了不同的指示因子（图S4d-e）。我们发现，两种示踪剂的CA活性差异与土壤性质和微生物群落在生物群落和土地利用梯度上的协变有关。观测到的土壤性质、微生物群落和CA活性的协同变化可用于土壤CA活性的经验模拟。

我们探究了特定类群是否主导了CA活动与群落范围内的多样性指标之间的相关性。我们发现k_COS与来自真菌谱系子囊菌门，担子菌门和接合菌门的19个操作分类单位（OTU）的相对丰度正相关，但是仅与来自细菌谱系的2个OTU（α-Proteobacteria）相关（表S7）。k_COS/ k_CO2与41种真菌OTU（主要来自Leotiomycetes类的子囊菌，但也有担子菌和接合菌）正相关，但只与3种细菌OUT相关。与此相反，k_COS/ k_CO2与18个细菌OTU，2个绿藻OTU（绿藻门）和仅4个真菌OTU呈负相关（表S7），并且在门水平上趋势相似（表S8）。

这些结果能够表明真菌在COS消耗中作用以及在CO2交换中藻类和细菌中的作用。

4 土壤CA的表达模式与土壤CA活性有关

我们对土壤宏转录组进行测序，以评估土壤CA基因表达模式是否是COS和CO₂的CA活性存在差异的原因。我们从基因组数据库（图S6）中发现的等效CA多样性的主要集群中构建定制的隐马尔可夫模型（HMM）。利用这些HMM，我们从十个土壤Meta图谱恢复了组装的CA基因。在我们的土壤中发现了三个CA类（α、β和γ）（表S9），而其他三个CA类（δ、η, and ζ）的系统发育分布趋于较窄，未发现明显的丰度。我们将CA表达水平表示为映射到组装的CA的原始转录本读取的相对tpm。土壤CA多样性以β-CA为主，γ-CA和α-CA在组合CA和读数上相对丰度较低（图3）。CA表现出可以在不同进化枝内的序列多样性（例如，β-CA的进化枝A-D）。土壤CA表达以支链D(图3b)的β-CA为主，特别是包含子囊菌和担子菌CA(簇129和11)的CA的β-CA HMM(图S7)，以及放线菌(簇207)和蛋白杆菌(簇6)参考基因组(图S8)。表达最多的γ-CA（簇15和628）表明放线菌是土壤中γ-CA表达的主要来源（图S7）。α-CA表达（簇145和154）与变形杆菌有关。CA表达在CA多样性和土壤分类群中的分布不均匀，表明土壤CA分布取决于土壤群落中CA表达成员的相对丰度。

图3 土壤CA的表达模式与土壤CA活性有关

进一步分析土壤CA表达水平，以确定特定类别的CA或表达CA的某类是否可预测COS和CO₂催化反应速率的趋势。k_COS的变化趋势与支链D中β-CA的CA表达水平（tpm；图3b）呈正相关（r=0.83，p<0.02），而β-A-CA的tpm和k_COS呈负相关（r=0.94，p<0.01），与支链B和C的关系不明显。对于k_CO2观察到与k_COS和β-CA之间的模式类似的模式，但缺乏显着性。k_CO2与β-D-CA 的关系较弱（r = 0.35，p> 0.05），而k_CO2与α-CA 的关系最强（r = 0.53，p> 0.05）。与β-CA相比，α-CA和γ-CA的趋势很难辨别，因为它们的回收率较低（表S9）。这些结果表明，CA酶哭可能部分重叠COS和CO₂，但不完全重叠。

讨论

土壤CA活性取决于CA的种内和种间多样性

我们提出COS和CO¹⁸O的土壤CA活性的差异取决于CA多样性，因为CA内在性质（如k_max/ K_m）随着CA类别的不同而不同。β-CA（1 s^-1μM^-1），比α-CA（0.001 s^-1μM^-1）具有显著更高的COS催化速率。相反，CO₂的CA活性差异相对较小，α-CA通常仅比β-CA（10 s^-1μM^-1）和γ- CA（10s^-1μM^-1）具有略高的k_cat/ K_m（100 s^-1μM^-1）。我们认为土壤中的COS水解是由β-CA驱动的，因为β-CA表达水平和COS亲和力很高。我们的结果表明，这种趋势可能主要归因于β-CA进化枝D，但β-CA动力学参数的类内变化尚不清楚。

羰基硫化物水解酶（COSase）是硫代硫杆菌中的β-D-CA，其对COS具有高亲和力而对CO₂具有较低的特异性。硫杆菌属OTU在我们的土壤中很少见，并且没有发现具有特征COSase氨基酸残基的CA。然而，分布在β-D-CA簇中的T.thioparusCOSase序列在土壤中具有最高丰度，并且可预测土壤中的COS消耗（图S6）。γ-CA的活性对COS的显著性尚不清楚，因为据我们所知，其对COS的内在活性尚未确定，但必须补偿相对较低的γ-CA丰度以匹配β-CA的重要性。由于在CO₂亲和力（对于α-CA更高）和土壤中CA表达水平（对于β-CA更高）之间的折衷，CO₂水合可能由α-CA和β-CA驱动。土壤CA活动的模型可以解释CA动力学参数的差异及其与生物群落和/或土壤微生物群落的变化，尽管在本研究之外，这些差异尚未被很好地编目。

核心菌群组中的土壤CA活性

我们检测了COS的土壤CA活性与子囊菌门，担子菌和放线菌的β-CA表达之间的一致性（图S7和S8），其中一些已知消耗COS。真菌基因组在基因组数据库中不足，但我们在构建我们的HMM时包括> 2000个真菌CA基因（α和β），并且在与真菌β-CA相关的簇中发现CA表达，而不是α-CA，这与对子囊菌的理解一致，即编码β-CA比α-CA具有更高的基因组频率。虽然在本研究中推断的真菌的作用可能受到以担子菌为代表的过量表达子囊菌的fITS9 / ITS4引物偏差的影响，但基于真菌预测COS的土壤CA活性观察进一步得到k_COS与相对丰度的相关性的支持。来自之前代表的类别的子囊菌OTU降低COS（Sordariomycetes和Leotiomycetes）和群落真菌多样性指标。真菌成为COS活动的重要驱动因素，并且在较低C:N比和耕作的农业系统中通常丰富度和多样性较低，这可以解释COS对土地利用的特殊敏感性以及我们观察到的k_COS/ k_CO2趋势（表1和S2）。这些结果与使用系统发育标记基因定量PCR（qPCR）对真菌的发现一致。CO₂的CA活性却是与α-CA相比与β-CA表达更相关。我们观察到α-CA表达的簇与变形菌门相关，而不是来自已知含有α-CA的其他组如子囊菌和厚壁菌门（图S8）。与β-CA相比，α-CA和γ-CA的低回收率使得用分类学评估统计关系和模式变得更加困难（表S8）。已知藻类如莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）在环境CO₂浓度下以高水平表达α-CA，并且已经在使用qPCR在光照条件下培育的土壤中显示了通过光养生物增强的CA活性。虽然我们观察到CO2的CA活性与藻类OTU的丰度之间的关系，但藻类CA的表达难以辨别，因为藻类在主要CA簇中没有很好地表达，只有一小部分mRNA来自微核生物，而我们的土壤在黑暗中培育。因此，我们的结果是基于我们对土壤中非光合作用CA活性的理解。

相关的知识空白

模拟影响土壤中COS和CO¹⁸O交换的关键土壤理化因子的模型可以在较大的时间尺度（数天到数年）内预测对其物理驱动因素（例如温度，湿度）的敏感性。然而，目前还没有系统的方法来估算驱动COS和CO¹⁸O通量差异的生物因子（如土壤CA活性）。我们在受控的实验室条件下使用土壤功能基因组学方法填充这一知识空白。我们利用基因组数据库和开发工具来分析土壤中的CA表达，这是第一次揭示了微生物分类学，CA基因和涉及COS和CO¹⁸O土壤通量的酶动力学之间的坚实的联系。这些关系表明，土壤CA活性也可能通过影响微生物群落组成和活动而对环境因素有着间接的敏感性，本研究也为未来的工作提供了充分的假设。我们提出土壤CA及其两种痕量气体底物（COS和CO¹⁸O）代表了一种有价值的基因-功能模型系统，用于探讨土壤微生物多样性对生态系统功能和大气成分的作用。

结论与展望

我们评估了土壤痕量气体交换在不同土壤中的物理，化学和生态驱动因素，发现微生物群落组成和基因表达的差异与COS和CO₂（k_COS和k_CO2）的土壤CA活性差异有关。COS消耗主要由来自子囊菌门，担子菌门，放线菌和变形菌门的β-CA（尤其是β-D-CA）驱动。CO₂水合主要由变形菌门或藻类的α-CA驱动，还有来自放线菌β-CA的贡献。子囊菌门，担子菌门，放线菌和变形杆菌是土壤微生物组中普遍存在且丰富的成员，这可能是土壤中CA活性在全球范围内的重要驱动因子。我们的研究结果可以直接解决如何预测COS和CO¹⁸O土壤交换率的问题。土壤气体交换率和CA活动随生物群落和土地利用而变化，可以从库存中估算出来。COS和CO¹⁸O的土壤CA活性是相关的，并且测量一个示踪剂的土壤CA活性可用来估计另一个。我们提出经验模型将CA活性作为单独的土壤功能，并结合土壤CA表达水平，可用于在适当的土壤性质或基因组数据库的情况下预测土壤CA活性。最后，我们确定了关键的微生物菌群和CA多样性，以指导酶反应动力学参数的选择，以更好地模拟土壤CA活性以及影响土壤中COS和CO¹⁸O气体交换速率的其他重要因素（如土壤温度，水分）。

未来要解决从序列数据中预测COS和CO²土壤CA活性这一难题，我们建议重点关注以下研究领域：

（1）需要有关CA在有机体(特别是真菌和藻类等微真核生物)中分布的新数据库，并与微生物分类学与环境中CA结合起来，鉴定动力学和生理学研究的分离物。

（2）CA的分布应在其他土壤和环境中表征，并随着时间推移，对宏基因组和宏转录组进行进一步分析，开发CA引物，重点研究微真核基因表达，以及深入分析土壤中活跃的微生物种群。如使用稳定同位素探测技术。

（3）需要测量COS和CO2与不同类型(例如，γ-CA)和CA的支链(β-CA支链)反应的动力学参数，以及评估可能消耗COS的酶（如CS2水解酶，RuBisCO，CO脱氢酶和固氮酶）和生产COS的其他酶（例如硫氰酸盐水解酶）。

这些进展与代表环境因素影响土壤痕量气体模型的进一步发展相结合，可帮助在各种相关的空间和时间尺度上限制土壤COS和CO¹⁸O气体通量。

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