科研 | 温带草地植物—土壤反馈受真菌多样性的调节
本文由木木的天空编译，董小橙、江舜尧编辑。
原创微文，欢迎转发转载。
导 读
植物与土壤微生物群落之间的反馈在植被动态中起着重要作用，但其潜在机制尚不明确。本文作者假定病原真菌、菌根真菌和腐生真菌的多样性是植物—土壤反馈的主要调节器，涉及广泛的温带草原植物物种。作者通过盆栽实验发现，具有资源获取特性的植物物种，如高的茎氮浓度和细根，吸引了不同群落的假定真菌病原体和专门的腐生菌，以及较低的菌根真菌多样性，导致植物生长在同一物种所占据的土壤上受到强烈的抑制作用。此外，土壤性质调节反馈于肥沃的土壤,促进土壤真菌与植物的拮抗关系。本研究通过揭示土壤性质，植物资源获取策略和土壤中真菌种类多样性之间的基本联系，提高了我们预测植物—土壤反馈和植被动态的能力。
论文ID
原名：Fungal diversity regulates plant-soil feedbacks intemperate grassland
译名：温带草地植物—土壤反馈受真菌多样性的调节
期刊：science advances
IF：11.51
发表时间：2018.11
通信作者：Marina Semchenko
通信作者单位：The University of Manchester
实验目的
① 探究病原真菌、菌根真菌和腐生真菌的组成和多样性，以及相关细菌和原生生物群落的组成如何控制植物—土壤反馈的结果。
② 温带草地上植物性状和土壤非生物特性的变化是否调节了植物—真菌的相互作用。
文章特色
作者采用两套实验，先对所需的土壤进行为期三个生长周期的调节然后再对被调节后的土壤进行植物—土壤反馈实验是一个很大的亮点。本文通过实验数据指出，土壤非生物特性通过植物性状中的表型可塑性间接地改变了特定反馈：越肥沃的土壤越易将植物性状从保守型转移到更强的资源获取型。且研究进一步证实生长速率快、寿命短、根系细的植物更容易遭受植物—土壤的负反馈这一论点。综合来看，植物性状与土壤生物和非生物特性紧密联系，共同决定了土壤生物区系对植物生长的净效应，而不是单一的决定植物—土壤反馈结果的因素。
实验方法
利用英国北部半干旱草原土壤，在野外建立14种常见温带草原物种的单一栽培模式，进行土壤调理阶段（预处理阶段）和反馈阶段（真正实验阶段）两不同的实验（PS: 14个物种简写与全称分别如下：Am, Achillea millefolium; Ao, Anthoxanthumodoratum; Bm, Briza media; Cc, Cynosurus cristatus; Cn, Centaurea nigra; Dg,Dactylis glomerata; Fr, Festuca rubra; Gp, Geranium pratense; Gr, Geum rivale;Hr, Hypochaeris radicata; Lh, Leontodon hispidus; Lv, Leucanthemum vulgare; Pl,Plantago lanceolata; Ra, Rumex acetosa.）。
图1 实验设计方案
1 土壤调节阶段
对14种常见草原物种进行单作栽培，每个种重复4次，在从单一草地收集的土壤中填充的大型中生植物中生长3个生长季节（注：实验中有一个重复样方死亡导致最终n=55）。
在调理阶段结束时，分别测定了各间系的植物性状、土壤非生物特性和微生物群落。简而言之，在第三个生长季中，每个样本至少有三株植物的叶子在生物量高峰期被取样，并在分析前以4℃温度储存。此外，从每个样本中取出直径为6.8cm的土芯并立即过筛4mm，然后从样品中再抽取部分子样品进行DNA提取。在分析之前，未透过筛子的根系被洗去泥土，且叶和根的性状按照标准化的方案进行量化。明确的来说，通过WinRHIZO（Regent Instruments Inc.，Ville deQuébec，Québec，Canada）扫描新鲜样品分析来确定叶面积，根长和直径。将样品新鲜称重并在60℃下干燥48小时，并计算比叶面积，特定根长度和叶和根干物质含量。在Elementar Vario元素分析仪（Hanau，Germany）上分别测定茎叶和根的N和C含量。剩余筛分的土壤用于定量测定其常规性的非生物性质指标。检查所有植物性状和土壤非生物性质的正态分布假设，并在用于下述模型之前根据需要进行对数转换。
2 反馈阶段
在实验的反馈阶段，每一种植物的8个幼苗作为单个个体被移植回：（i）4个重复的同种土壤（每种土壤2个重复幼苗），（ii）4个重复的同种土壤且被γ辐射灭菌（剂量> 25Gy）（每种土壤2个重复幼苗），（iii）八个随机选择的异种特定土壤（即先前被其他物种占据）。随机分配异质特异性土壤，使每个样本中的土壤在最终数据集中时得到均等的表示。
最初种植每种物种24株幼苗，即总共336株幼苗（收获时测量323株幼苗）。将种子在无菌沙子上发芽，并将幼苗移植到装有300g土壤（干重）的0.5升盆中。将所有土壤放入盆中沉淀一周，并用水冲洗三次，以减少灭菌对土壤养分有效性的影响。在实验过程中将盆位置随机化两次。每天浇灌盆，使得在实验开始时土壤水分达到60％的持水能力，且实验过程中将土壤水分重置至该水平两次。植物在温度为22℃的温室中生长，额外的照明具有16/8小时的日/夜循环。生长60天后收获植物枝条和根，并在70℃下干燥48小时。
两个植物—土壤反馈指标的计算：
1）生物反馈：其计算方法为在活的和灭菌的同种土壤中对数转化（loge-）的植物干质量之间的差异。在计算之前对来自相同样本土壤上生长的两个幼苗的干质量进行平均，得到每个植物物种的四个反馈值以反映独立的土壤重复。
2）特定土壤反馈：其计算为在同种活土壤和其他物种条件下土壤中对数转化（loge-）的干质量之间的差异。计算每种植物物种内同种与异种土壤中植物干物质的所有成对组合的反馈（即每种物种64种组合）。
3 微生物测序
在土壤调节阶段结束时，从各间系土壤样品中提取DNA，标记基因经聚合酶链反应扩增，用于微生物群落的特征鉴定[真菌核糖体RNA (rRNA)操纵子的内部转录间隔，16S rRNA用于细菌，18S rRNA用于原生生物。]。扩增子在Illumina MiSeq仪器上用2x151碱基对测序。
4 系统发育信号
使用Durka于2012年发表在Ecology杂志中的植物系统发育评估手段评价了系统发育信号在解释植物物种特性对土壤微生物特性和植物—土壤反馈的影响中的重要性。此外，利用Mantel检验检验植物物种间的系统发育距离是否能够解释物种间不同的病原真菌、菌根真菌和腐生真菌所占的比例。
5 土壤微生物群落及植物—土壤反馈的差异
为证实病原真菌和菌根真菌的多样性比真菌组成的差异更能预测生物反馈，采用Mantel测试评估生物反馈与真菌组成之间的相关性。为检验特定土壤反馈对土壤真菌组成变化的敏感性，利用对数转化生物量和真菌测序数据，计算了同种土壤和异种土壤中各物种个体间的两两差异。利用Hellinger变换得到的相对丰度数据，计算微生物间的差异为Bray-Curtis距离。构建了三个功能类群的分离距离矩阵:病原真菌、菌根真菌和腐生真菌。利用999个限制性排列(在每个植物物种的同种和异种处理范围内)，对每个植物物种的生物量距离和微生物群落距离之间正相关关系的重要性进行了测试。
实验结果
1 不同植物种对不同真菌类群的相对丰度和多样性有明显影响
图2 不同真菌群中的真菌序列的相对丰度。图2中A、B、C分别代表病原真菌、菌根真菌和腐生真菌。均值±标准误（n = 55）。植物物种特性（蓝色圆圈）主要解释了病原真菌和菌根真菌的相对丰度的差异，而植物特性和土壤理化性质的变化（褐色圆圈）则解释了腐生真菌丰度的差异。方差解释是基于调整后的R2。条形图上方的数字表示专业分类群的平均丰富度（少于5种植物物种的分类），白色数字表示通用分类群的平均丰富度（超过10种植物物种的分类群）。植物系统发育显示在图的底部。物种缩写见图1。* P <0.05，** P <0.01，*** P <0.001。
使用高通量标记基因测序对土壤微生物群落进行表征发现（图2），当真菌被分为病原真菌、菌根真菌和腐生真菌时，植物种类对土壤真菌群落的独特影响变得更加明显。三种真菌群落的相对丰度在不同种类土壤条件下存在显著性差异。植物在病原真菌和菌根真菌的相对丰度方面留下了最强的影响，而腐生真菌更受土壤非生物条件的影响。同时，植物种类在积累病原真菌的趋势上有很大的差异性，但对菌根真菌和腐生真菌的积累上没有差异。因此，植物种类对不同真菌类群的相对丰度和多样性留下了不同的土壤影响力，这些变化有望对后续植物生长产生特定的反馈。
2 植物种类、性状和土壤性质对植物—土壤反馈的影响
图3 植物物种特性，植物性状和土壤特性对植物—土壤反馈的影响。（A）研究的植物物种中生物反馈和特定反馈（平均值±标准误）的变化。其负值表示经过灭菌土壤(顶部) 或受异质特异性影响的土壤(底部)的条件下植物生长更加旺盛。（B）影响生物反馈的变量路径分析。（C）影响特定反馈的变量的路径分析。其红色箭头表示正相关，蓝色箭头表示负相关。纯色表示显著相关(P < 0.05)，半透明箭头表示边际非显著关系(P < 0.1)。对于非均质土壤性质，不显著关系(0.1 < P < 0.4)用虚线表示。给出了标准化的路径系数。所有测试都基于n = 55。非生物性状和植物性状分别为土壤理化性状(正值越大表示土壤肥力越高)和植物性状数据(正值越大表示资源获取性状越多)的第一主成分;腐生菌组成是指腐生真菌组成的第一主坐标。
在本研究的反馈阶段，将每一种植物的幼苗作为单个个体种植到重复的土壤中，这些土壤之前是由同种特定物和随机选择的8种异质特定物组成的，每一种土壤都由不同的植物物种组成(图1)。第二组幼苗种植在经过伽玛辐照灭菌的同种土壤中。计算了两种植物-土壤反馈指标(图1)。生物反馈的计算方法是在同种土壤中生长的活的植物生物量与经过伽玛辐照灭菌的同一土壤生物量的比值，反映了植物与土壤生物群相互作用的净结果。特定反馈计算为在活的同种土壤和活的异种土壤中生长的植物质量比，因此描述了不同植物种类对土壤性质的特定变化的反应。该指数的负值越高，说明同一物种所占土壤上的植物生长较差，预计这一过程将促进植物群落中稳定的物种共存。
从图3数据中我们可以发现，相对于未经灭菌的同种土壤，植物平均生长量是灭菌量的2.8倍（即负生物反馈）。这种效果可能是由于灭菌的土壤中死亡微生物生物质释放的养分。然而，生物反馈的变化并不能用释放到土壤中可溶性氮的数量来解释[即硝酸盐，铵和溶解的有机氮（DON）的总和] （ R2 = 0.04， F = 2.1， P =0.154）。生物负反馈的大小因植物种类而异（调整后的R2 = 0.66， F 13,41= 9.2， P<0.001），但不能通过物种间的系统发育关系来预测(Blomberg's K = 0.22,P = 0.441;Pagel's λ = 0.22, P =0.389;图3A)。相反，生物反馈的大小最好通过土壤中推定的病原真菌和菌根真菌的丰富度来预测（R2 = 0.48;路径分析模型拟合χ2=16.5，P= 0.350，比较拟合指数（CFI）= 0.99 ，均方根残差（SRMR）= 0.076; 图3B ）。
3 植物性状、土壤性质与土壤反馈强度的关系
图4 植物性状、土壤性质和植物—土壤反馈强度之间的关系。（A至J ）生物反馈是指植物对土壤灭菌的反应，特定反馈是指植物对同种特异性土壤与异种特异性土壤的反应（如图1所示）。植物性状，土壤非生物性质和腐生真菌组成分别是植物性状数据和土壤非生物性质的第一主要成分和真菌腐生菌群落的第一主要坐标。植物性状轴与芽N％和比叶面积呈正相关，与土壤中根干质量密度和枝条碳氮比呈负相关。菌根真菌丰度是指归类为菌根真菌的序列读数的相对丰度。腐生菌多样性是指专家型腐生真菌的香农指数多样性。实线表示回归线，阴影区域表示95％置信区间。* P <0.05，** P <0.01，*** P <0.001。
从图4中的A和B数据可以发现，对于那些积累了更多种类的病原真菌群落的植物物种来说，生物反馈始终是更加负面的，但对于那些支持菌根真菌相对丰度和丰富度较高的土壤的植物物种来说，其生物反馈的负面影响较小。两种植物性状，茎N浓度和平均根直径，被确定为生物反馈量的重要预测因子。具有较细根的植物物种受到来自土壤生物群的更多负面影响（图4C），而茎部N浓度较高的物种积累的菌根真菌较少，并吸引了更多样化的假定真菌病原体群落，导致其与土壤微生物组的净相互作用呈现更大的负相关(图3B和4D、E)。以往的研究表明，生长速率快、寿命短、根系细的植物更容易遭受植物—土壤的负反馈。我们的结果确定了植物资源获取策略，假定病原真菌和菌根真菌以及植物—土壤反馈结果之间的机制联系。植物性状与土壤生物和非生物特性紧密联系，共同决定了土壤生物区系对植物生长的净效应，而不是单一的决定植物—土壤反馈结果的因素(图3B)。
植物性状对土壤真菌病原菌和土壤微生物群落多样性的影响是相反的，植物性状与土壤微生物群落之间的联系只有在单独考虑不同的植物相关真菌时才会显现出来，而在考虑整个真菌、细菌和后生动物群落的组成时则无法检测到。
与先前由同种植物占据的土壤相比，当在其他物种调节的活土壤上生长时，植物平均积累的生物量平均增加24％，表明植物和土壤群落之间的负特定反馈。然而，特定反馈的变化不能通过植物物种身份来解释（基于随机化测试调整的R 2 <0.01， P = 0.181; 图3A ）。与以往对叶片病原真菌在近缘种间传播水平高的研究相反，植物物种间的系统发育距离并不能解释特定反馈的变异(Blomberg's K = 0.17, P = 0.688; Pagel'sλ< 0.01, P = 1;图3A)。然而，土壤非生物性质的变化显著改变了植物与土壤真菌之间相互作用的性质，在固有的肥沃土壤中观察到更多的负特异性反馈（路径分析模型拟合χ2= 20.1， P =0.985，CFI= 1，SRMR= 0.059; 图3C）。而特定反馈与同种土壤中腐生真菌组成之间的显著关系(图4F)表明，某些腐生真菌在持续暴露于植物单株栽培时，可能会向生物营养模式转变。
土壤非生物特性也通过植物性状中的表型可塑性间接地改变了特定反馈：越肥沃的土壤越易将植物性状从保守型转移到更强的资源获取型（图4G）。这种效应与假定病原菌的丰度增加、菌根真菌的相对丰度降低（图3C和4H）及腐生真菌的多样性增加有关，最终促进了植物生长的更大的负特异性反馈（图3C和4I、J）。总体来说，这些影响可能是由于菌根真菌对植物组织具有保护作用，相反，病原真菌的多样性增加了专家腐生真菌可利用的死亡组织的丰度。
结 论
本篇文章表明，预测植物—土壤反馈的能力需要更好地了解植物与植物病原体和共生体的不同群落间的相互作用，而不是单一宿主特异性病原体。病原真菌和互惠真菌的存在和缺失，以及不同种类的菌根真菌（外菌根真菌和丛植菌根真菌），被认为是植物—土壤反馈的关键调节因子。作者通过对病原真菌、菌根真菌和腐生真菌三个类群分析表明，这些类群的丰富程度对决定植物的表现也至关重要，从而为生物多样性调节群落动态和生态系统功能提供了一条新的途径。同时该研究也进一步证明了土壤真菌多样性对植物-土壤反馈的影响在土壤真菌的关键类群之间存在显著差异，这些反馈的共同结果决定了植物的生产力和可能的植物竞争相互作用，且，植物养分获取策略和土壤肥力是植物—土壤反馈的重要调节因子，资源开发植物种类和肥沃土壤促进负反馈。
编译者的个人思考
思考1：作者的研究只集中于温带草原物种上，其中值得一提的是——叶片氮浓度和根直径等特征是植物—土壤反馈的两个关键预测因子，反映了在全球范围内运作的植物策略的变异。但是后续若想让该结论攻不可破，需要来自其他生态系统的经验数据来探索这里所观察到的关系的一般性，其中也必定包括真菌多样性在其他非生物和生物因素背景下植物—土壤反馈的重要性。
思考2：文章中的实验完全来自于盆栽实验，其优点是实验设备与环境较易于控制，能够排除其他非实验条件的扰动。但是，这种室内盆栽最大的缺点是不能够完全反应自然界多因素扰动形成的叠加效果，那么该文章中的室内盆栽实验结果究竟与自然环境下的天然植物—土壤反馈结果是否一致，还有待进一步探究。总结近些年来比较好的期刊我们会发现，如今的室内模拟实验想要发高质量期刊是愈发艰难，除非你有更好的idea和爆炸性的研究结果。当下想要发表好文章，很多核心期刊主编和学者更青睐于室外自然条件研究为主，然后再以室内的配套为辅，总体来讲就是自然环境原位+室内实验互相佐证，而不单单是只进行自然环境原位或室内实验其中的一个。
你可能还喜欢
培训班推荐👇，快来参加，充实自己吧！