编译：I AM Spring，编辑：小菌菌、江舜尧。
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导读
甲烷菌在限制湖泊甲烷排放方面起着关键作用。一般认为，甲烷营养菌主要活跃于在分层湖泊的含氧-缺氧过渡带，它们利用氧气氧化甲烷。本研究描述了一种甲基杆菌属的甲烷氧化菌，该菌株在温带的Lacamas湖（华盛顿，美国）的缺氧条件下可以进行高效率的甲烷氧化（高达72μM day-1），同时受到硝酸盐和硫酸盐的刺激。缺氧培养和有氧培养都表明甲基杆菌属对甲烷的氧化作用，缺氧率高三倍。在缺氧条件下中，甲基杆菌细胞数在三天内增加了几乎两个数量级，这表明这种特定的甲基杆菌是兼性厌氧菌，具有快速反应能力。基因组分析揭示甲基杆菌对氧限制的适应，并参与混合酸发酵和H2产生的途径。甲基杆菌参与的反硝化途径不完全，其缺少narG / napA和nosZ基因，仅允许甲烷氧化与亚硝酸盐还原反应耦合。本研究数据表明，在缺氧的湖泊体系中，甲基杆菌可能是甲烷转化的一个重要驱动因素，并利用替代的电子受体或发酵在缺氧条件下保持活性。
原名：Methane oxidation in anoxic lake water stimulated by nitrate and sulfateddition
译名：硝酸盐和硫酸盐添加对缺氧湖水中甲烷的氧化作用
期刊：Enironmental Microbiology
IF：5.147
发表时间：2019.12
通讯作者：Sigrid van Grinsven
作者单位：NIOZ荷兰皇家海洋研究所，乌得勒支大学
用于试验样品于2016年8月23-31日和2017年2月6-10日采自美国华盛顿Lacamas湖中心（水深17.8 m）。Lacamas湖是环境保护署列出的富营养化系统。它是单原子的，在5月建立了热分层，从10月到12月的氧跃层逐渐加深和减弱。氧跃层的深度利用带有电导率，温度，溶解氧，pH传感器的Hydrolab DS5X测定. 使用Technicon TRAACS 800自动分析仪.测定NO3- , NO21 , SO42-浓度。测定甲烷氧化速率，样品直接取样到12毫升容器中，对于每个深度测定，选用16个容器，其中4个约用50μl饱和氯化锌溶液（ZnCl 2）处理，立即添加以终止生物活性。将容器存储在黑暗的，温度±2°C的水浴中。在孵育开始后的每个时间点，在每个时间点将约50μl饱和ZnCl 2溶液注入四个容器中，用作重复。每个细胞的甲烷氧化速率是用每L的氧化速率除以每L的细胞数来计算的。倍增时间计算公式为:倍增时间= t/(3.3*log(b/B))，其中t为h中的时间，b为tend细胞数，B为t0时的细胞数。微生物群落取样和分析：PowerSoil DNA提取试剂盒提取DNA之后进行16S rRNA测序、pmoA基因扩增，系统发育分析。pmoA基因扩增子序列通过BLAST对NCBI的非冗余核苷酸(NT)数据库进行分类分配。样品进行宏基因组测序分析及特定编码基因的鉴定和系统发育分析。在MAG bin-63中，甲烷代谢的特定编码基因，以及参与潜在好氧和厌氧呼吸的编码基因均未被注释。Prokka和RAST通过利用蛋白质序列参考数据集进行蛋白质blast搜索进行了进一步的研究。
1. 物理化学特性
8月下旬的采样中，湖水分层，呈现缺氧、富甲烷的状态(38-270 µM CH4 ;图1)。氧跃层位于3-5m。在5-9m处，硝酸盐浓度为10-20μM，但在浅水区（3 m）和深水区（15-17m）中，尽管流入流中的浓度很高，硝酸盐浓度<0.5 μM(图1)。浅水中的硫酸盐浓度约为20 µM，并在17 m处逐渐降低至9 µM，低于流入水流的硫酸盐浓度（48 µM；图1）。在二月份的冬季采样期间，甲烷浓度低(0.2-0.8 µM; 图1)。水柱中的硝酸盐浓度比夏季高4至300倍，而进水中的硝酸盐浓度已降至60 µM。整个水柱中，冬季水柱中的硫酸盐浓度为17-18μM（图1）。全年亚硝酸盐浓度较低（0.1-1μM；图1）。
图1 Lacamas湖在2016年8月（黑色正方形）和2017年2月（灰色圆圈）的理化条件：A.溶解氧浓度，B.温度（ºC），C.溶解的甲烷浓度，D.硫酸盐浓度，E.硝酸盐浓度，F.亚硝酸盐浓度。所有浓度单位均为µmol L -1。D，E和F中0 m处的数据点分别代表夏季和冬季在湖泊上游1.5 km采样的进水口中硫酸盐，硝酸盐和亚硝酸盐的浓度。
2. 甲烷氧化率
在夏季，甲烷净氧化速率范围为7.3至46μM每天，在深水层7和15 m达到峰值（图2A，表S1）。实验表明，在7 m处，> 60％的甲烷在24小时内被氧化，而在9-15 m处，甲烷仅被氧化6–16％（表S1）。尽管自然存在溶解的甲烷（2.2–2.7μM；表S1），但在夏季水柱的含氧区（深度3-5m）中未检测到甲烷氧化。硝酸盐和硫酸盐的添加提高了除7 m以外的所有测量深度（5–15 m）的甲烷氧化速率。硝酸盐和硫酸盐刺激甲烷氧化的速率比对照速率高8倍，在12m添加硝酸盐甲烷氧化速率达72μM day-1，在15,m添加硫酸盐甲烷氧化速率达74μM day-1（图2A）。在12m的缺氧水中加入腐殖质和氧气，甲烷的氧化作用完全消失（图S1）。冬季，水柱中的甲烷浓度<1 µM，未检测到甲烷氧化（图1和2B）。为了测试甲烷氧化的潜力，将甲烷浓度增加到150-260μM，对应于夏季（表S1）进行低碳发酵。在缺氧条件下，潜在的甲烷氧化速率为37 μM day-1，比在17 m深度条件下高3倍（图2B）。在12 m处，在缺氧条件下，甲烷在每天氧化速率为20 µM，而在有氧条件下，甲烷浓度随时间增加。
图2 .甲烷氧化速率（A）夏季；（B）冬季。在图A中，自然条件（浅灰色圆圈），硝酸盐富集条件（黑色三角形）和硫酸盐富集条件（深灰色正方形）。灰色阴影表示缺氧区域。在图B中，显示了深度为12和17 m的样品的自然有氧条件（深灰色倒三角形），添加了甲烷的有氧条件（灰色菱形）和添加了甲烷的无氧条件（黑色星号）。
3. 水层中甲烷菌的鉴定和丰度
本研究通过16S rRNA基因扩增子测序获得的OTUs。检测到的OTUs包括甲基球菌目，尤其是Methylomonas，Methylobacter clade 2，Crenotrichaceae以及pLW和CABC2E06 (图3）。甲烷菌夏季明显高于冬季（图4；表S2）。在夏季，除3 m以外，其他深度都检测到甲烷氧化菌（图4A）。它们的多样性和相对丰度在7-9m处最高（图4A）。在7 m处，甲烷营养菌占所有16S rRNA基因读数的5％（表S2），其中甲基球菌pLW组含量最高。在深部缺氧水柱中，> 12 m，Methylobacter clade 2最丰富（图4A）。没有检测到甲烷氧化古细菌（ANME）。在冬季，除了15 m处，整个水柱中仅存在Methylobacter clade 2（图4B；表S2）。功能基因（pmoA）扩增子分析表明存在四个OTUs，其中两个占主导地位（图4C-D）。在夏季，水柱的上部由LL-PmoA OTU LL-pmoA-3主导（图4C），其来自酸性森林土壤富集培养的一个基因组与Methylobacter sp.KS41Mendota 77–78％相同。夏季水柱的较深部分由OTU LL-pmoA-1主导（图4C），而在冬季，OTU LL-pmoA-1也主导了整个水柱（图4D）。与PmoA关系最密切的是来自Methylobacter sp.KS41的一个基因组。与OTU LL-pmoA-1和-3的紧密相关的是tundripaludum菌株（图5），属于Methylobacter clade 2（图3）。
图3 16S rRNA系统发育树。
图4夏季和冬季Lacamas湖中甲烷菌群落的丰度与组成。
4. 试验中甲烷菌的鉴定和丰度
在不添加甲烷的情况下，添加硝酸盐或硫酸盐进行试验，研究电子受体的有效性对甲烷氧化速率和甲烷群落的影响。相对对照组，添加硝酸盐或硫酸盐增加了甲烷菌的相对丰度 (表S2)。Methylobacter clade 2最丰富（约占总16S rRNA基因读数的12％），其中硝酸盐添加的的培养液中含有大量LL-16S-16和LL-16S-19（图3）。夏季，添加硝酸盐对PmoA OTUs LL-pmoA-4和LL-pmoA-2的丰度略有促进（Fig. 4C)。硫酸盐的添加模拟了较深水层的条件，并导致OTU LL-pmoA-1序列具有强优势(图4;图S2)。在冬天，当水层中的氧气充满，甲烷耗尽时，从12 m深度向水中添加甲烷会导致Methylobacter clade 2的相对丰度从0.7增加到7％（图6）。此外，在缺氧，富含甲烷（194μM）的条件下进行试验，Methylobacter clade 2绝对丰度提高了100倍以上（图6）。OTU LL-16S-16是最丰富的一种，占35.4％（图3）。在缺氧条件下，还检测到其他几种甲烷氧化菌，尽管其相对丰度比Methylobacter clade 2（0.1-1％；图6）低得多。在深度为17 m的水中观察到了相似的结果，尽管孵育中的绝对丰度较低（图S3）。pmoA基因扩增子分析显示，LL-pmoA-1 OTU在所有冬季孵育中均保持优势（图S2），就像在冬季水层中一样（图4D）。
图5所示PmoA蛋白序列系统发育树。
图6所示。冬季试验中甲烷菌群落的丰度。在三个试验中OTU LL-pmoA-1占主导。
5. 甲基杆菌种宏基因组分析
冬季在缺氧条件下添加甲烷导致甲烷菌富集，其中Methylobacter clade 2的成员占所有16S rRNA基因读数的三分之一（35.4％）以上。采用宏基因组学方法进行测序后，产生了几个由基因组组装的基因组（MAG），包括与甲基球菌相关的三个MAG（bin-19，-37和-63）（表S4）。MAG bin-63具有很高的质量，并且具有最高的平均丰度。所获得的三个MAG与甲基杆菌属物种最密切相关，Methylobacter clade 2 中的Methylobacter sp.KS41（图S5）。MAG bin-63隶属于Methylomonadaceae(图S6)。此外，MAG bin-63与16S rRNA基因序列Methylobacter clade 2密切相关（图3）。MAG bin-63的PmoA蛋白序列与甲基杆菌属的PmoA蛋白序列具有95.5％的同一性。OTU LL-pmoA-1与从MAG bin-63中检索到的pmoA基因编码序列并不相同，但是该OTU代表了获得该基因组的样品中97％的总pmoA基因序列， MAG bin 63的pmoA和OTU LL-pmoA-1都相同。MAG bin-63具有高平均丰度（表S4），其与Methylobacter clade2的基因序列有最近同源性（图3），本研究得出结论：MAG bin-63很可能与Methylobacter clade2有关，并且代表了甲基细菌物种的种类，该物种在夏季主要存在于Lacamas湖的缺氧性水生动物中，而冬季则在整个有氧水层中存在，但数量较少。
6. 甲基杆菌MAG bin-63的基因组代谢
与其他MAG相比，由于其高质量和最高的平均丰度，将重点探究MAG bin-63的代谢潜力。所有编码甲烷单加氧酶（pMMO）的基因都存在于pmoCAB操纵子中。MAG bin-63存在用于甲醛同化的完整RuMP途径的基因，以及用于氧化TCA循环的基因（图7）。鉴定存在与H4叶酸（mtdA-fch），膜相关的喹蛋白甲醛脱氢酶（ald）和甲酸氧化（fds）有关的基因（图7；补充文件S1）。除了亚甲基四氢甲蝶呤脱氢酶（mtdB，见图7）外，还存在H4 MTP C-1转移的基因。MAG bin-63具有从丙酮酸到琥珀酸的遗传潜力，通过乙酰辅酶A从丙酮酸盐变成乙酸盐（图S4）。但其缺乏从丙酮酸形成乳酸的基因，以及从丙酮酸经由乙酰磷酸盐到乙酸盐的完整途径（图S4）。MAG还包括双向NAD还原加氢酶Hox基因，该基因可以产生氢或将H 2用作电子供体（见图S4）。MAG bin-63编码了两种类型的好氧呼吸链复合物（图S4）：质子泵浦I型NADH脱氢酶。MAG bin-63还编码细胞色素c氧化酶复合物（即cyoE，coxCAB）和细胞色素bd氧化酶复合物（图S4）末端还原酶的基因。检测到，反硝化途径不完全：存在涉及异化硝酸盐还原的nirK和norB基因（图7，补充文件S1），但不存在异化硝酸盐还原酶（narG）和一氧化二氮还原酶（nosZ）基因。
图7 MAG bin-63代谢途径。
Lacamas 湖具有较高的甲烷氧化速率。甲烷氧化菌把甲烷氧化和亚硝酸盐还原结合在一起，也是在缺氧水层中进行甲烷氧化的潜在候选者。然而，本研究中，Methylobacter clade 2在夏季丰富。Methylobacter clade 2不仅在有氧条件下而且在缺氧环境下也能繁盛生长，虽然在缺氧培养试验开始时可能存在少量的氧，但由于取样或处理过程中的氧污染，我们可以排除这是甲烷氧化的驱动因素。首先，甲烷随时间的减少呈高度线性，并且在前6小时内没有显示出氧化的增加，如果氧气污染会刺激甲烷的氧化速率，这是可以预料到的。其次，在夏季培养试验中加入12m的缺氧水可以减少甲烷氧化(图S1)，表明高氧浓度可以抑制甲烷氧化，考虑到好氧甲烷氧化的化学计量比为2：1，因此氧气污染仅能占到容器中最初氧化的0.15–0.2μM，仅占总氧化甲烷的0.3％。尽管我们不能排除存在微量的氧气，但是氧气的量根本不够高，不足以解释被氧化的甲烷量。已知有几种甲烷氧化菌含有编码硝酸盐还原途径部分的基因。即使在缺氧培养实验中添加了硫酸盐刺激的甲烷氧化，在MAG bin-63的基因组中也没有发现与硫酸盐还原有关的代谢途径（图2）。在这里，我们通过分析哪些微生物相对丰度高或相对丰度增加以及甲基细菌种类的增加，确定了甲基细菌种类。与伯克霍尔德里亚氏菌（Betaproteobacteria）相关的序列在Lacamas湖中大量出现。这些族群的成员被描述为能够吸收琥珀酸酯，同时使用硝酸盐作为电子受体（Saito等，2008）。它们经常与甲烷微生物同时存在，将甲醇氧化与硝酸盐还原偶联。此外，在缺氧的夏季水层中，Sulfuritalea非常丰富，从分层湖的水柱中分离出了Sulfuritalea hydroivorans，其为兼性厌氧菌，它能够利用硝酸盐作为电子受体来氧化硫代硫酸盐和氢。在富氧和缺氧的湖泊中经常发现甲烷菌。本研究检测甲基杆菌属可以在缺氧条件下氧化大量的甲烷，这对我们理解分层湖泊中的甲烷氧化具有重要的意义，因为它将甲烷氧化的空间范围扩展到了缺氧亚极带。本研究结果还表明，混合酸发酵产生的有机化合物，在氧气限制条件下由特定的甲基杆菌属产生甲烷。这些排出的化合物可能被非甲烷微生物利用，这将对甲烷衍生碳化合物的循环和湖泊系统的微生物群落结构产生重要影响。
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