科研 | Nature：肠道微生物组将突变的p53从抑癌转变为致癌
编译：小范儿，编辑：小菌菌、江舜尧。
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p53的体细胞突变使p53的肿瘤抑制功能失活，并通常赋予致癌的功能获得特性，在癌症中非常常见。本文研究由Csnk1a1缺失或ApcMin突变引起的WNT驱动的肠癌小鼠模型中Trp53（在小鼠中编码p53的基因）的热点功能突变的影响。已知这些模型中的癌症由p53缺失引起。发现p53突变体在肠道的不同部分具有对比作用：在远端肠道中，p53突变体具有预期的致瘤作用;然而，在近肠和肿瘤类器官中，它有明显的肿瘤抑制作用。在肿瘤抑制模式下，突变体p53消除Csnk1a1缺陷和ApcMin / +小鼠的异常增生和肿瘤发生，并促进这些小鼠衍生的类器官的正常生长和分化。在这些情况下，突变型p53比野生型p53在抑制肿瘤形成方面更有效。从机制上讲，突变型p53的肿瘤抑制作用是通过阻止WNT途径（通过阻止TCF4与染色质的结合）来驱动的。值得注意的是，肠道微生物组完全消除这种肿瘤抑制作用。此外，一种来自肠道微生物的单一代谢物—没食子酸，可以重现微生物组的全部效果。用没食子酸补充经肠道灭菌的p53突变小鼠和p53突变类器官，可恢复TCF4染色质相互作用和WNT的过度活化，赋予类器官和整个肠道以恶性表型。研究证明癌症突变的可塑性，并强调微环境在决定其功能预后方面的作用。
论文ID
原名：The gut microbiome switches mutant p53 from tumour-suppressive to oncogenic
译名：肠道微生物组将突变的p53从抑癌转变为致癌
期刊：Nature
IF：42.778
时间：2020.07.29
通讯作者：Yinon Ben-Neriah
通讯作者单位：以色列耶路撒冷希伯来大学-哈达萨医学院医学研究所以色列劳顿伯格免疫学和癌症研究中心
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实验设计
主要内容
1 p53突变体在肠道中的异常作用
为了研究突变体p53在肠道肿瘤发生中的作用，首先使用Csnk1a1floxed / Vil1-Cre-ERT2小鼠模型，其中在肠道上皮中有条件地缺失Cskn1a1（CKIa），激活野生型p533。比较在Trp53中具有构象性R172H热点突变的CKIa缺失小鼠（为简单起见，该基因在下文中称为p53，而将突变称为p53R172H）与具有野生型p53或无p53的CKIa缺失小鼠（以下简称“CKIaΔgutp53R172H，CKIaΔgut或CKIaΔgutp53Δgut）。蛋白质稳定是有效获得功能作用的先决条件。在正常的小鼠肠道上皮中，p53的表达较低，并且局限于肠道隐窝。删除CKIa后，野生型和突变型p53蛋白被高度稳定化，特别是在肠道上皮中（图1a），其表达水平与那些表征p53突变的肿瘤的表达水平相似。因此，删除CKIa为研究p53突变体在肠道癌变中的作用提供一种途径。通过对不同基因型小鼠的近端(十二指肠和空肠)和远端(回肠和结肠)胃肠道的组织学分析，比较CKIafl/fl(几乎是野生型)小鼠的癌症表型。如先前所示，CKIaΔgut小鼠在肠上皮发育异常中保持肠道稳态，而CKIaΔgutp53Δgut小鼠整个肠表现出高度异常增生（以PROX1表达为标志），并且增殖增强（图1a–c）。然而，CKIaΔgutp53R172H小鼠在不同的肠段表现出相反的表型：相比CKIaΔgut和CKIaΔgutp53Δgut小鼠，结肠和回肠上皮高度发育异常和增生，十二指肠和空肠增生正常，绒毛异常轻微，空肠隐窝明显缩短。
图1 突变的p53可以抵消近端肠道的异常增生和肿瘤发生，而不会恢复野生型转录活性
a，小鼠空肠肠上皮细胞的免疫印迹。b、c、小鼠空肠和回肠侵袭和发育异常标记物PROX1(b)和增殖标记物Ki67(c)的免疫组化。d，小鼠空肠肠上皮细胞的p53ChIP-seq衍生热图。e，小鼠肠不同节段的代表性图像。箭头指示可见肿瘤。f，肿瘤大小（每只鼠标用颜色标记）。
当CKI的缺失与p53突变体的表达结合时，在10天内是致命的，因此不会导致不连续的肿瘤(息肉或癌)发展。为了评估突变体p53的功能获得特性，比较CKIa缺失三天后CKIaΔgutp53R172H小鼠与CKIaΔgutp53Δgut小鼠的肠表型。在这个时间点，CKIaΔgutp53R172H小鼠的远端肠已经显示出高度的异常增生，而CKIaΔgutp53Δgut小鼠的肠病理却很少。值得注意的是，CKIaΔgut小鼠中具有p53R270H突变与具有p53R172H结构突变的小鼠的肠表型相似。CKIaΔgutp53R270H小鼠在近端肠道中未见侵袭或过度增殖的迹象，但远端胃肠道高度异常增生和增殖。这些数据表明，在近端肠道中，突变体p53破坏p53缺失的促癌作用，并减弱CKIaΔgut小鼠的轻度增生和发育异常表型。
野生型p53具有主要的抗致癌作用，部分是通过转录激活抗增殖和促凋亡基因，如p21(又称Cdkn1a)和Bax。因此，p53突变体在空肠抑制肿瘤的一个可能解释是这种转录激活的恢复，然而，尽管突变体p53在CKIα丢失后得到明显的稳定（图1a），但相对于肠道上皮中的经典p53靶基因而言，它在转录上是无活性的。观察到p53的促凋亡和细胞周期抑制性靶基因在CKIaΔgut小鼠中高表达，但在CKIaΔgutp53R172H小鼠中却不表达，与CKIaΔgutp53Δgut小鼠相似，它几乎不表达p53靶基因。此外，染色质免疫沉淀和测序(ChIP-seq)分析显示，与野生型p53相比，p53(R172H)与染色质的相互作用几乎完全消失(图1d)，证实突变型p53在空肠中的抑瘤作用不依赖于正常p53转录。
为了检测突变的p53在不连续肠道肿瘤小鼠模型中的作用，用ApcMin/+小鼠模型饲养p53R172H突变小鼠。在这种常用的小鼠模型中，典型的腺瘤肿瘤是在Apc杂合性丧失和WNT过度活化后产生的，并且该肿瘤主要发生在近端肠道，很少或没有结肠肿瘤。与CKIaΔgutp53R172H小鼠一样，将p53R172H突变引入ApcMin / +小鼠可增强结肠的肿瘤发生能力，但可减轻近端胃肠道的肿瘤负担（图1e，f）。总之，结果表明，突变p53在两种小鼠wnt驱动的癌症模型中具有二分效应：抑制近端肠道的肿瘤发生，但增强远端肠道的肿瘤发生。
2 突变的p53阻断TCF-WNT通路
野生型p53抑制一组称为“p53抑制的侵袭性标记”（PSIS）基因的表达。PSIS基因与多种侵袭功能有关，其中许多基因是WNT信号的靶标。为了检查WNT信号是否也被突变体p53抑制，检查CKIaΔgutp53R172H小鼠空肠和回肠中几个WNT靶基因的表达水平。如所预期的，在CKIaΔgut小鼠的空肠中WNT靶基因适当激活，在CKIaΔgutp53Δgut小鼠的空肠中观察到更强的激活。相比之下，CKIaΔgutp53R172H小鼠在空肠中显示出所有测试的WNT靶基因的较低表达水平，与突变体p53的肿瘤抑制活性一致（图2a，b）。值得注意的是，在CKIaΔgutp53R172H小鼠的空肠肠上皮细胞中，细胞周期蛋白D1和Myc显著WNT驱动原癌基因的表达水平降低至CKIafl / fl水平，这对于肠道肿瘤的发生至关重要。(图2a, b)。相比之下，WNT靶基因在CKIaΔgutp53R172H小鼠的回肠和结肠中表达较高，其表达水平与CKIaΔgut和CKIaΔgutp53Δgut小鼠相似（图2c）。为了证实突变体p53对WNT调控基因表达的优先影响，比较CKIaΔgutp53R172H小鼠与CKIaΔgutp53Δgut小鼠的空肠和回肠肠上皮细胞的转录组。该分析表明，突变体p53的作用在WNT主导的基因组中最为明显，仅在空肠肠上皮细胞中才明显。没有其他途径显示在近端或远端胃肠道的两种小鼠基因型之间具有相似程度的变异，表明突变体p53对WNT的抑制作用是特异性的，而不是整体的基因组现象。
为了更好地了解突变体p53阻止WNT激活的机制，分析导致WNT靶基因转录激活的主要步骤。WNT途径的激活需要β-catenin的积累及其核易位。在缺乏CKIa的小鼠空肠中，非磷酸化（活性）和总核水平的β-catenin均升高，在不同CKIa缺陷基因型之间无显着差异。β-catenin是一种转录共激活因子，它依赖于T细胞因子（TCF）和淋巴增强因子（LEF）转录因子。TCF4（肠道上皮中的主要TCF）与染色质组成性结合，并需要与β-catenin结合以促进WNT转录。对空肠绒毛和隐窝上皮细胞的ChIP分析表明，在CKIaΔgutp53R172H小鼠（而非CKIaΔgutp53Δgut）中，TCF4与染色质的结合仅限于隐窝腔室（图2d）。H3K4me3ChIP证实WNT活性特别存在于CKIaΔgutp53R172H小鼠的隐窝中。突变体p53的这种隐窝保护效应可能解释了近端CKIaΔgutp53R172H肠道内稳态的维持。
图2 突变的p53抑制近肠WNT靶点的表达
a，c，小鼠空肠（a）和回肠（c）中WNT靶标的IHC。b，小鼠空肠肠上皮细胞的免疫印迹。d，小鼠空肠隐窝和绒毛部分中WNT目标启动子的TCF4 ChIP。
3 突变p53对细胞自主WNT的抑制
尽管突变体p53在空肠和回肠中的稳定性相似，但它仅抑制空肠中的WNT活性。为了确定这种差异的来源，我们准备表达野生型p53基因（分别为p53R172H和无p53）的ckia缺失的空肠和回肠类器官。干细胞来源的肠类器官是由分化的细胞的圆形核和围绕该核的增殖性外突组成。这些分别类似于绒毛和隐窝隔室。如先前报道，敲除CKIa后不久，由于p53靶基因的表达，敲除CKIa的类器官死亡。相比之下，具有双重敲除CKIa和p53（CKIa / p53DKO）的类器官具有高度增殖性。这些类器官表现出WNT过度活化，未能分化并且类似于高度发育异常的球状体，没有出牙（图3a）。突变体p53的表达挽救了空肠和回肠CKIa缺失的类器官，这可能是由于诱导类器官凋亡的经典p53靶基因的丢失。但是，与CKIa / p53 DKO类器官不同，表达p53R172H（CKIaKOp53R172H）的CKIa敲除类器官表现出正常的类器官分化，中等的WNT活性和增殖并减少异型增生，而与类器官的肠道来源无关，突出突变的p53对细胞自主抗增殖和促进分化的作用(图3a)。因此，突变体p53也具有在回肠中发挥抗致瘤作用的潜力，但是在体内环境中转变为促癌活性。
为了测试人类突变体p53是否具有与小鼠相似的肿瘤抑制能力，在CKIa / p53 DKO类器官中过表达突变体p53的R175H和R273H人类同源物以及GFP。通过GFP显像识别表达人类突变p53和GFP或仅表达GFP的有机体，并对p53、GFP和Ki67进行表型评估和免疫荧光染色。与突变体在类器官和近端小鼠肠道中的肿瘤抑制作用一致，人类突变体p53消除CKIa / p53 DKO类器官的转化表型。表达人类突变体p53的类器官继续生长，但通过典型的隐窝突触和Ki67的CKIafl / fl样再分布进行分化（图3b）。值得注意的是，如果有足够的时间，癌细胞可能会逐渐改变其信号传导途径，以最大限度地发挥其内源性突变体p53的功能获得作用，最终使其“上瘾”。因此，外源性突变的p53在新制造的p53缺失的类器官中的表达不一定与内源性突变效应相吻合。与CKIa / p53 DKO类器官相似，ApcMin / Min腺瘤类器官是高度增殖的球体，具有牢固的Ki67染色，这是在野生型p53稳定的情况下发生的（图3c）。在过表达人类突变体p53-GFP后，40-50%的腺瘤组织样体在生长过程中经历表型分化转换，而仅表达GFP的腺瘤组织样体均未发生表型转换(图3b, c)。总之，这些数据表明，p53突变体的肿瘤抑制能力远远超过野生型p53，并且足以消除源自不同肠道癌模型的类器官中已建立的致瘤表型。
图3 p53突变促进肠道肿瘤类器官正常平衡的生长和分化。
a，回肠类器官中Ki67和WNT靶点的免疫荧光染色。b，分化的类器官占GFP阳性总数的百分比。c、GFP与p53(内源性和转导)或Ki67在慢病毒转导的类器官中的亮场成像和免疫荧光融合。
4 肠道微生物群使突变的p53变为致癌物质
胃肠道是一个复杂的栖息地，含有丰富的微生物，微生物的数量沿着胃肠道逐渐增加：微生物组和宿主细胞之间的持续串扰通常是由微生物群衍生的代谢产物进行的，对于维持组织体内稳态至关重要。菌群失调（微生物菌群的负荷或组成的扰动）与各种疾病密切相关；例如，肥胖，炎症和癌症。研究表明，突变的p53仅在近段肠道和无菌回肠器官中抑制WNT和肿瘤发生，我们推测，肠道菌群可能阻碍p53在远段肠道中对WNT的抑制。为了验证这一理论，通过用抗生素混合物处理小鼠消除肠道菌群，并通过16S核糖体RNA（rRNA）分析证实肠道细菌的消灭（扩展数据图7a）。值得注意的是，抗生素仅影响CKIaΔgutp53R172H小鼠：在这些小鼠中，用抗生素治疗可抵消结肠和回肠中观察到的异型增生，并且小鼠在这些区域的隐窝较短且绒毛组织更好（图4a）。同样，根除肠道菌群会导致WNT活化降低，特别是在CKIaΔgutp53R172H小鼠的回肠和结肠中的细胞增殖降低（图4b，c）。所以数据表明肠道菌群对抗由突变p53介导的WNT的抑制，从而促进远端肠癌的发生。
图4 抗生素治疗可使突变的p53在远端肠道产生抑制肿瘤的作用
a，b，用抗生素混合物（ABX）处理的小鼠回肠中苏木精和曙红（H＆E）染色的切片（a）和Ki67的IHC（b）。c，RT-qPCR检测小鼠回肠细胞中WNT靶基因。
5 没食子酸模拟微生物群效应
通过细菌16S rRNA测序对微生物区系组成的分析表明，CKIafl / fl和CKIafl / flp53R172H小鼠之间的物种没有重大差异。因此，突变体p53不太可能通过生态失调间接地促成肿瘤发生。肠道共生细菌，尤其是其代谢产物，对结直肠癌的易感性有很大的影响。因此，推测存在于远端而非近端肠道中的特定细菌衍生代谢物可能具有抵消突变体p53的WNT抑制作用的潜力。为了验证该假设，在CKIaKOp53R172H空肠类器官中进行粗代谢物筛选。类器官用来自四个主要亚组的代谢物处理，已证明这些代谢物具有通常与肿瘤发生有关的表观遗传作用：短链脂肪酸（例如丁酸和己酸）；脂质衍生物（例如，脱氧胆酸盐）；异硫氰酸盐（例如，萝卜硫烷）；和多酚（例如，尿石素B，鞣花酸和没食子酸）。在处理过的类器官体和未处理的类器官中检测类器官形态，增殖能力和WNT活性。短链脂肪酸，脂质衍生物或异硫氰酸酯对形态没有明显影响，而多酚导致类器官变圆，多酚处理的类器官的形态类似于WNT活性CKIa / p53 DKO类器官。在测试的多酚中，只有没食子酸显着提高CKIaKOp53R172H类器官的增殖能力和WNT活性。用没食子酸处理后，CKIafl / fl和CKIafl / flp53R172H类器官的形态没有改变，表明没食子酸特别削弱突变体p53抑制WNT过度活化的能力。同样，向表达人类突变体p53的CKIa /p53 DKO和ApcMin/ Min类器官给予没食子酸可将突变体p53诱导的分化表型逆转为以球状体为特征的无转化表型。最后，检测是否需要通过从类器官培养基中去除没食子酸来维持抑制突变体p53的抗肿瘤发生作用，而没必要使用没食子酸。除去没食子酸四天后，CKIaKOp53R172H类器官丧失其超WNT增生特性，并恢复为正常的类器官外观，其中WNT的表达仅限于类器官的外露。表明需要连续存在没食子酸以防止突变体p53的肿瘤抑制特性。
为了研究没食子酸对体内WNT抑制和肠道肿瘤发生的影响，首先测量空肠（细菌稀疏）和回肠（细菌密集）中没食子酸的含量，并发现小肠远端水平较高。没食子酸是由3-脱氢莽草酸在细菌酶莽草酸脱氢酶(SDH)的作用下形成的。两种细菌菌株—植物乳杆菌和枯草芽孢杆菌—已被明确鉴定为人类没食子酸的生产者。我们在CKIafl/fl和CKIafl/flp53R172H小鼠的粪便和黏膜中鉴定这些菌株(枯草芽孢杆菌aroE和植物芽孢杆菌aroc2)的SDH编码基因，两种小鼠基因型之间无显著差异。抗生素处理消除小鼠粪便中几乎所有SDH基因的拷贝，改善CKIaΔgutp53R172H小鼠的肿瘤发生（图4）。没食子酸处理会特别影响CKIaΔgutp53R172H小鼠的空肠特性。它变得高度增殖，并伴有大量高级别的发育异常灶（图5a）。然后在ApcMin / +小鼠模型中检测没食子酸的作用。没食子酸处理完全消除突变型p53介导的ApcMin / + p53R172H小鼠近端肠道肿瘤的抑制，但对表达野生型p53（ApcMin / + p53WT）的ApcMin / +小鼠无效。类似于我们在基于CKIaΔgut的小鼠模型中的发现，这种微生物代谢产物的作用是通过突变体p53介导的（图5b，c）。
值得注意的是，与类器官的结果一致，用没食子酸治疗小鼠逆转突变体p53的WNT抑制作用。用没食子酸处理可以使CKIaΔgutp53R172H小鼠空肠肠上皮细胞的基因组WNT启动子上的TCF4-染色质缔合和H3K4me3修饰（图5d），诱导WNT目标基因的表达。此外，转录组分析突出显示WNT是没食子酸处理的CKIaΔgutp53R172H小鼠空肠中受影响最大的途径（图5e）。与DNA复制和链伸长相关的基因集也高度富集，可能是由WNT激活引起的。补充没食子酸消除用抗生素治疗的CKIaΔgutp53R172H小鼠远端肠内突变p53的肿瘤抑制活性。小鼠回肠和结肠变得过度增生，具有丰富的高度不典型增生灶，并且在整个回肠和结肠中高度诱导WNT靶基因（图5f）。总而言之，数据表明，没食子酸是由人类和小鼠中都存在的细菌物种产生的，并且仅在远端肠道内自然丰富，能完全复制肠道微生物群在消除突变p53的肿瘤抑制活性方面的作用。
图5 当p53突变时，没食子酸诱导wnt驱动的异常增生和肿瘤发生
a，用没食子酸（GA）处理或未处理（NT）的小鼠空肠中Ki67的IHC。b，小鼠肠不同节段的代表性图像。c，每只小鼠可见肿瘤的定量。d，小鼠空肠肠上皮细胞中WNT靶标启动子的TCF4 ChIP。e，在没食子酸处理和未处理的CKIaΔgutp53R172H小鼠空肠中差异表达的富集基因集的过度表达分析。f，小鼠回肠肠上皮细胞的免疫印迹。
讨论
研究揭示突变的p53具有显著的功能可塑性，并显示微生物在塑造这种可塑性中的指导作用。最常见的两种突变体p53亚型在近端小鼠肠道中具有强大的肿瘤抑制作用，超过野生型p53的作用：突变体p53抑制CKIaΔgut小鼠中WNT驱动的过度增殖和发育异常以及ApcMin / +小鼠中的肿瘤发生。这些抑制肿瘤的作用被完全消除，取而代之的是通过与原生肠道菌群接合，或特别是通过补充没食子酸，转化为致癌的功能获得活性。用没食子酸治疗如何覆盖突变p53阻断wnt的作用尚不清楚，但其可逆作用为癌症的预防和治疗提供可能的选择。例如，通过饮食管理，没食子酸合成抑制剂和没食子酸拮抗剂。其他微生物来源的代谢物也可能充当突变体p53的类似调节剂，或者通过肿瘤基质和免疫系统产生某些间接代谢物作用。
TP53的功能获得突变也普遍存在于天生缺乏任何实质性微生物的肿瘤组织中，因此，这些突变可能比功能缺失突变更受不涉及微生物群的机制的青睐。值得注意的是，TP53和CTNNB1的突变是人类肝癌最常见的驱动因素，但它们之间相互排斥，表明在肝细胞中，WNT可能被p53突变抑制。因此，TP53中某些获得功能突变可能优先显示wnt驱动的肿瘤抑制功能。假设p53突变在人类中具有类似的作用，那么选择p53突变作为肿瘤抑制实体可能对维持组织内稳态有价值。体细胞p53突变相当普遍，似乎促进了健康人皮肤和老化食管中的克隆选择。为什么p53突变比其他致癌突变与无形扩增更有相关还不清楚。我们很容易推测突变的p53在衰老或组织损伤中有双重作用，在促进无性扩增的同时也促进正常的分化。组织损伤和损失可能触发代偿生长机制，除非得到分化能力的支持，否则无法发挥作用。p53突变的阳性选择可以促进功能性克隆的扩展，可能与WNT信号的改变有关—类似于在肠类器官中观察到的p53突变的影响。值得注意的是，WNT抑制剂SFRP2和SFRP1的高甲基化分别发生在73%的正常食管和96%的受损Barrett食管。因此，尽管种系TP53突变是有害的，而且容易导致多种癌症的早期发病，但局部的体细胞TP53突变—尤其是年龄增长时—可能是一种有益的保护手段。这种程序性逆转的拮抗多效性可能解释了p53突变的可塑性，以及为什么p53如此容易发生突变而不是像大多数其他肿瘤抑制基因一样消融。
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