科研 | Cell：绘制全器官尺度的人类心脏发育的单细胞基因表达时空图谱
编译：不二，编辑：十九、江舜尧。
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论文ID
原名：A Spatiotemporal Organ-Wide Gene Expression and Cell Atlas of the Developing Human Heart
译名：人类心脏发育的一个时空器官尺度的基因表达和细胞图谱
期刊：Cell
IF：36.216
发表时间：2019年12月
通讯作者：Michaela Asp 和 Joakim Lundeberg
通讯作者单位：瑞典皇家理工学院基因技术研究所
DOI号：10.1016/j.cell.2019.11.025
实验设计
研究者展示了一个时空表达图谱，该图谱系统地描述了妊娠早期人类胚胎心脏三个发育阶段的细胞异质性和空间位置，分别是：受孕后4.5-5、6.5和9周（PCW）（图1）。利用空间转录组学（ST）的探索能力、scRNA-seq单细胞测序的解析能力以及原位测序（ISS）的靶向亚细胞的分辨率来创建此图谱。最后，研究者整合所有结果以及空间位置信息生成三维（3D）基因表达图谱。
图1 实验设计概况
结果
人类心脏发育过程中的时空基因表达特征
研究者通过免疫组织化学（IHC）染色对4.5-5、6.5和9 PCW采集的人类胚胎心脏样本的组织切片进行了人类心脏发育的时空表达研究（图2A-2C）。结果显示左心室和右心室以及左心房和右心房（TNNT2）的自由壁和间隔在所有时间点均由紧凑的小梁心室心肌组成。此外，平滑肌肌动蛋白（ACTA2）染色显示，主动脉和肺动脉的形成开始于4.5-5 PCW的心脏，并在6.5和9 PCW心脏中进一步发育。DAPI（4,6-二氨基-2-苯基吲哚）染色显示在所有三个时间点包围心脏的心外膜边界都有信号。但是，6.5和9 PCW时期，可以形成冠状动脉（ACTA2）的心房和心室（AV）心外膜间质仅在AV沟的上端可见。最后，在大动脉进入纵隔的心包腔末端，观察到大量的肺静脉纵隔组织（ACTA2），这些仅在6.5和9 PCW的心脏中可见。总之，IHC染色揭示了人类心脏发育过程中蛋白的时空表达模式。但是，该分析受到一组预选抗体的限制。
为了扩展该研究，研究者借助了空间转录组学（ST）来探索人类心脏发育过程中的基因时空表达特征。具体来说，在4.5-5、6.5和9 PCW心脏组织中，沿背腹轴分别收集了4个、9个和6个组织切片。总数据集包含3115个单独的位置点（每张切片上每个位置点约有30个细胞），过滤后每个位置点平均约有1700个基因和约3800个唯一转录本。通过Pearson相关性检测了技术重复之间的相似性，发现在基因表达水平上所有发育阶段都是可比较的。为了研究这三个发育阶段之间的生物学差异，研究者计算了样本之间的基因表达相关性，结果显示在所有发育阶段的整体基因表达模式都非常相似。然后对这三个阶段的空间基因表达谱进行了降维和聚类。确定了10个时空保守的细胞簇（图2D），并将这些细胞簇映射回原始的组织切片中。令人惊讶的是，这些细胞簇与所有三个心脏中解剖区域相对应（图2E–2G）。所有发育阶段都共享了主要的心肌细胞区域（细胞簇0、1、2、3和4），并反映了心脏的生长，因为这些细胞簇中的位置点数量随年龄增长而增加。与其他两个年龄相比，4.5-5 PCW组织中流出道（OFT）和较大血管细胞（细胞簇5）代表性不足，主要是AV间质细胞（细胞簇6）。此外，含有血细胞和免疫细胞的腔（细胞簇8）在6.5 PCW组织中较多，该位置点中的血细胞比其他两颗心脏要多。
进而对解剖区域之间进行了差异基因表达（DGE）分析（图2H），并对每个细胞簇的上调基因进行了基因富集分析。在所有心肌细胞簇（细胞簇0、1、2、3和4）中都检测到了与肌肉收缩和发育相关的基因本体论（GO）特征，而紧凑型心肌细胞（细胞簇0）则与新陈代谢相关。三个小梁细胞簇（细胞簇1、2和3）可以通过传导（细胞簇1和2）和氧化代谢（细胞簇3）的富集来区分。另外，细胞簇2表现出MB和NPPA的差异表达（图2H），这与增强的氧转运和内分泌活性有关。因此，不同的小梁心肌细胞簇可能对应于小梁的不同组成部分，例如与心壁相关的乳头肌或Purkinje纤维。心房心肌细胞（细胞簇4）还显示了NPPA的差异表达（图2H），以及与传导和心率调节相关基因的差异表达。另一方面，OFT、AV、纵隔间质以及心外膜（细胞簇5、6、7和9）表现出相似的GO特征；它们与细胞外基质、不同程度的脉管系统和动脉形态发生相关。细胞簇5、6和7与心脏瓣膜和隔膜发育相关。细胞簇9显示心外膜标记基因ALDH1A2、LRP2和ITLN1的表达，以及心外膜和心外膜衍生细胞（EPDC）标记基因TBX18的表达（图2H）。在两个稍晚的发育阶段（6.5和9 PCW）的样本中，对OFT细胞簇（细胞簇5）的深入研究发现富含成纤维细胞相关的细胞外基质基因（如ELN、SPARC和OGN）的表达以及平滑肌相关基因（例如ACTA2和MYH11）的表达（图2H）。这些标记基因在较早的4.5-5 PCW组织的AV间质的远端部分表达不高，这表明尽管OFT从AV间质中生长出来，但其肌肉化和较大血管的形成开始于远端的心脏神经嵴细胞。
总之，这些结果表明，在研究的发育阶段（4.5-9 PCW）内，空间基因表达早在胚胎发育中就已建立，在整个胚胎发育过程中维持，并且心脏内不同区域之间基因表达的差异比不同发育阶段之间的差异更为明显。
图2 三个心脏发育阶段的全基因时空分析
6.5-7 PCW人类胚胎心脏的单细胞基因表达分析
由于ST的位置点平均包含约30个细胞的基因表达特征，所以使用scRNA-seq分析了6.5 PCW组织样本的基因表达异质性。具体来说，检测了6.5-7 PCW样本的生物学重复（例如第二个人类胚胎心脏组织样本），因为IHC染色表明中间发育阶段可以表现出其他两个发育阶段中识别的解剖特征。将组织解剖为两个区域不同的部分：一个包含了OFT、AV结构和大部分心房，另一个包含了心室。这有助于细胞解离，同时保留了所研究的细胞来自心脏上部或下部的信息。使用10X Genomics Chromium平台，数据经过质量过滤后，生成了3717个单细胞转录谱，平均每个细胞约有2900个基因以及约11000个唯一转录本。
为了验证该6.5 PCW心脏样本是ST分析的6.5 PCW心脏样本的生物学重复，研究者比较了这两个样本的scRNA-seq和ST分析的基因表达相似性，并观察到很强的相关性（r=0.93；图3A），证明生物学比较的合理性。鉴定出两个6.5 PCW样本之间共有18046个基因，2027个仅在scRNA-seq样本中表达，而1174个是ST样本特有的。在ST样本中唯一检测到的大多数基因是Y连锁基因（例如TTTY14、TTTY15和ZFY），这是由于不同性别导致的结果。在scRNA-seq样本中XIST基因的过表达进一步证实了这一点。此外，在检测仅在scRNA-seq样本中发现的基因时，研究者观察到了与免疫反应（例如FCGR2B和IL6）以及细胞增殖和凋亡（IL1B）相关的基因的表达，表明这些过程在细胞文库制备之前细胞解离步骤被激活。
最后，对这两个单细胞成分的基因表达谱进行了降维和聚类，并鉴定了15个细胞簇（图3B），根据标记基因的表达将其分类为具体的细胞类型。鉴定出已知的心脏细胞类型，从心肌细胞和成纤维细胞到平滑肌细胞和内皮细胞。此外，检测到了三种类型的心肌细胞，心脏神经嵴细胞，Schwann祖细胞，心外膜细胞；EPDC；两种内皮细胞和四种成纤维样细胞。这些细胞簇仅在心脏上部中检测到（图3C），表明心脏上部具有丰富的细胞多样性，其中包括OFT、心房的主要部分、AV心外膜下间质、瓣膜和带有肺静脉的纵隔组织。
图3 6.5–7 PCW人类胚胎心脏的单细胞分析
创建发育心脏的细胞基因表达图谱
为了阐明人类胚胎心脏中存在的不同细胞类型的空间分布及其空间分布的异质性，通过将原位测序（ISS）应用于ST分析的3种心脏组织来研究ISS的亚细胞空间分辨率，从而能够在单细胞分辨率下对基因进行时空表达分析。为此，利用两个匹配的6.5-7 PCW生物样本的ST和scRNA-seq分析的信息，该研究设计了一个基因panel。具体来说，初始基因panel的一半由ST鉴定的关键空间标记基因组成，另一半由每个scRNA-seq细胞簇的标记基因（免疫细胞除外）组成，以分析细胞类型的异质性。随后添加了已报道的对心脏发育很重要的基因，最终包含69个基因。使用69个基因重新对scRNA-seq数据进行聚类，能够将大多数细胞分配到它们的原始细胞簇中。唯一的例外是细胞簇13，它不含特定的标记基因。进而对所有三个心脏的重复进行了ISS实验，并观察到时间阶段的高度相关性（R2=0.85-0.99）。该研究还使用单分子RNA荧光原位杂交（smFISH）对三个ISS基因探针的结果进行了交叉验证（图4），得到的基因表达模式与测序观察到的模式相似。
图4 通过smFISH验证ISS数据
最后，研究者使用ISS和pci-Seq方法的强大功能，利用在6.5-7 PCW人类胚胎心脏中scRNA-seq鉴定的细胞类型，创建了全面空间细胞图谱（图5）。除空间位置外，细胞映射算法还将scRNA-seq数据读数分配给单个细胞（图5A，5C和5E）。该空间图谱包括20920个单细胞，这些单细胞成功分配给由scRNA-seq鉴定的细胞类型（不包括红细胞和免疫细胞，这些细胞未从分析中排除）（图5B和5D）。空间细胞映射验证了ST预测的细胞簇空间分布，并且解析了由彼此紧邻的不同细胞类型形成的更精细的结构。
图5 中间发育阶段人类心脏发育的细胞类型图谱
通过空间分析解析细胞类型相似性
ISS分析揭示了清晰的空间基因表达模式，与6.5-7 PCW心脏（免疫细胞和红细胞未包括在分析中）的ST和scRNA-seq结果一致。图6A-6B给出了这三种技术之间的一致性示例。通过比较scRNA-seq结果与相应空间标记基因的结果，ISS的结果使科研人员对几个scRNA-seq细胞簇有了更深入的了解。
值得注意的是，在细胞簇14中发现了两个细胞类型亚群：表达ISL1和STMN2的心脏神经嵴细胞；以及表达ALDH1A1的Schwann祖细胞（图6A）。两种细胞类型均存在于纵隔间质和OFT中，并且沿着AV心外膜下间质还可以检测到Schwann祖细胞。通过分析三个发育阶段OFT中这些基因的ISS的模式，研究发现心脏神经嵴细胞仅出现在早期阶段，而Schwann祖细胞仅出现在晚期阶段（图6C和6D）。此外，在所有发育阶段，AV心外膜下间质中均不存在心脏神经嵴细胞，但在晚期阶段中，Schwann祖细胞充满了该区域（图6E和6F）。
本研究还阐明了心外膜细胞（细胞簇9）和EPDC（细胞簇3）之间的主要区别。心外膜细胞的特征在于ITLN1的表达，其表达在心脏周围的心外膜层中。两种细胞类型都表达了标记基因TBX18，而TCF21则更多地位于心外膜下发现的EPDC中（图6B）。图6E和6F中显示了时间分析，展示了所有三个发育阶段AV心外膜下间质的心外膜细胞（ITLN1，TBX18）和EPDC（TBX18）的定位。在4.5-5 PCW的心脏中，心外膜几乎不覆盖心脏的心包表面，仅可检测到发育心外膜的痕迹。相反，在稍晚的两个时间点，由EPDC形成并填充了AV心外膜下间质。其他技术重复也获得了相似的结果。
本研究还解析了由EPDC（细胞簇3）和成纤维样细胞（细胞簇2、4、5和8）组成的scRNA-seq细胞簇组合体（图3B）。对这些细胞簇的深入研究表明，它们具有不同的空间位置以及独特的功能。EPDC主要存在于AV心外膜下间质中（图6G），主要参与器官和肌肉的发育。在成纤维样细胞中，与细胞簇2相关的细胞主要位于OFT的底部和瓣膜中，而细胞簇5主要位于OFT内部，并参与其形态发生。细胞簇5也出现在AV心外膜下间质中，表明其参与冠状动脉形成。细胞簇4和8具有相似的空间分布。然而，细胞簇4在皮下层更明显，并参与结缔组织的发育和血管生成，而细胞簇8则稍微偏向OFT，并且更具体地与动脉和主动脉的形态发生以及内皮细胞增殖的调节相关。
图6 心脏三个发育阶段的靶向时空分析
重要的是，研究发现了三种类型的心肌细胞（图3B），并且在所研究的三个发育阶段都检测到。其中两种细胞表达了心房和心室心肌细胞的标记基因，并与其空间定位一致。相反，表达MYOZ2和FABP3的第三种细胞既位于心房，又位于心室，但先前在人类心脏发育中并未描述。研究者将这种富含Myoz2表达的心肌细胞命名为新的细胞类型。
最后，对两种内皮细胞类型（细胞簇0和10）进行更仔细的空间检测发现，前一种细胞类型（毛细血管内皮）主要位于小梁心肌，那边的血液主要通过较小的血管（主要是毛细血管）供应。相反，后一种细胞类型（内皮/周细胞/外膜）主要位于致密的心肌中，冠状动脉向心脏提供富氧的血液。这些发现共同证明了空间基因表达分析在区分相似细胞类型的定位和功能的关键作用。
为了方便使用该研究图谱，研究者提供了一个公共可用的网络资源，以可视方式展示人类心脏发育的空间基因表达模式（https://hdca-sweden.scilifelab.se/a-study-on-human-heart-development/）。此资源包含用于分析ST和scRNA-seq数据的浏览器、ISS信息的图谱以及6.5 PCW胚胎心脏的3D图谱。可以查询3D模型的9个ST组织切片的整体和单个空间基因表达模式，以便研究心脏器官发生的总体和详细的动态（图7A）。此外，将源自ISS数据的空间细胞图谱与3D模型相整合以提供单细胞的分辨率（图7B）。
图7 3D基因表达图谱
讨论
对于调节器官和疾病发展的不同细胞类型的生物学功能、分子网络和相互作用的了解，需要各个细胞的信息及空间背景。各种开创性的将空间信息与scRNA-seq数据相结合的方法已经报道。但是，大多数方法都是利用现有的原位杂交标记基因数据来研究模式生物发育的。由于模式生物无法反映物种之间的细微差异，这类信息无法轻易应用于人体器官发生的研究。因此，需要对人类发育组织的单细胞转录数据进行空间分布研究。
本研究提出了一种创新的方法，该方法结合了三种不同技术（ST、scRNA-seq和ISS）的功能，可以在器官范围内以单细胞分辨率全面表征人类心脏形态发生过程中基因表达的时空差异。从三个不同发育阶段（4.5-5、6.5-7和9 PCW）的4种人类胚胎心脏中获得了转录数据，从而能够分析心脏形成过程。虽然在更早的人类心脏组织中研究其形成过程将更有意义，但这样做实际上会带来很大的困难。
每一个技术都具有关键的功能，使研究者能够生成人类心脏细胞图谱。作者利用ST的探索能力来确定三个发育阶段共有的空间基因的表达模式。此外，使用scRNA-seq解析中间发育阶段的细胞类型异质性。这两种技术的结合使研究者能够识别出一套全面的基因探针来概括空间位置和细胞信息，从而重新构建人类心脏发育的整体复杂性。最后，ISS的靶向分辨率使研究者能够对三个发育阶段创建完善的亚细胞基因表达图谱。通过这种方式，研究者建立了一种在细胞水平上研究人类心脏发育的时空基因表达模式的分子方法。
对这些技术的联合使用表明，空间基因表达模式在胚胎心脏发育早期已建立（4.5-5 PCW），并一直维持到9 PCW。特别是，研究者观察到在心室和心房心肌、AV间质、心外膜和OFT区域中保守的空间基因表达模式。相反，在三个发育阶段的心外膜、EPDC的形成，成纤维细胞、血管结构、纤维环、瓣膜和肌肉结构的形成之间存在时空差异。具体而言，在单细胞分析中，由ST鉴定的心外膜空间标记基因由心外膜细胞和EPDC这两种细胞类型表达。这些基因包含在本研究中的ISS基因panel中，表明尽管4.5-5 PCW心脏的表面被心外膜细胞覆盖，但上皮细胞到间质细胞转变的EPDC的形成才刚刚开始。在稍晚的发育阶段，EPDC的形成在AV心外膜下间质中继续进行，并可能促进了几种成纤维样细胞类型的分化。对于EPDC是否也可以分化为心肌细胞或通过外泌体影响心肌细胞分化尚不清楚。
另一个值得注意的发现是心脏神经嵴细胞和Schwann祖细胞表现出不同的时空表达模式。具体而言，在心脏发育的早期阶段，心脏神经嵴细胞独特地存在于纵隔和OFT中。这与Keyte等人的结果一致，心脏神经嵴细胞对于OFT分离成主动脉和肺部部分极其重要。相反，在发育的晚期阶段，Schwann祖细胞首先出现在纵隔和OFT中。此外，它们仅在发育的晚期阶段才能在AV心外膜下间质区域内见到。心脏神经嵴细胞和Schwann祖细胞之间的确切关系最终尚未解决。本研究中的方法还能够确定由EPDC和四种不同的成纤维样细胞类型组成的scRNA-seq细胞簇组合体之间的差异，以及两种内皮细胞类型之间的差异。在较早的研究中观察到了这类细胞簇组合体，但并未对其进行解析。研究者发现四种成纤维样细胞类型和两种内皮细胞类型都有特定的空间位置，并在心脏发育过程中发挥不同的功能。此外，还发现了一种独特的成纤维样细胞类型（成纤维样细胞/平滑肌细胞，scRNA-seq细胞簇5）与内皮细胞一起，在心脏发育中促进了冠状动脉的形成。
评论
总之，研究者使用单细胞时空方法研究了人类心脏的发育，并创建了一种分子方法，可用于探索信息很少的其他生物体的发育过程。该方法可以探索组织中的整体空间基因表达模式，解析其细胞异质性，解析细胞类型差异的空间异质表达模式的靶向关键基因。本研究中的人类心脏发育图谱是首个具有单细胞空间分辨率的人类器官发育转录图谱。为了促进其开发，研究者创建了一个公共访问的网络资源，可用于查看心脏发育过程中的时空基因表达模式的2D和3D图谱（https://hdca-sweden.scilifelab.se/a-study-on-human-heart-development/）。这些图谱表明，单细胞基因表达数据的时空信息的整合，对于鉴定不同细胞类型之间的关键差异以及对发育中的组织进行详细分析至关重要。
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