NAT REV GENET | 新生RNA分析：跟踪转录及其调控
推荐：江舜尧
编译：荟氚
编辑：马莉
康奈尔大学分子生物学和遗传学系John T. Lis等共同于2019年8月9日在Nature Reviews Genetics 上发表了题名为《Nascent RNA analyses: tracking transcription and its regulation》的文章。该研究评估了一系列用于研究初生转录的策略，并讨论了它们最近在概念上的进展, 对基因调控和转录耦合RNA处理的机制提供了新的见解。
文中重要图片说明
图1 |转录周期。a图示的|是一个典型基因(上面板)和增强子(下面板)的结构，描述了影响转录和转录稳定性的DNA元素。无论是基因启动子还是增强子，基因特异性转录因子(TFs)的结合位点都位于驱动转录分化的两个核心启动区之间。在基因中，编码链的转录(如右图所示)从转录起始位点(转录起始位点)开始，并通过存在5 '剪接位点(即U1基序)203而产生稳定的mRNA。反义链的转录(如左图所示)是从一个不同的TSS开始的，并产生一个不稳定的上游反义RNA (uaRNA)，缺乏U1基序s203。增强子rna (eRNAs)与uaRNAs相似之处在于它们短而不稳定，并且它们有一个聚腺苷酸化信号(PAS)，但没有一个U1 motif f4。转录周期由七个步骤组成。在第1步，一个先锋TF结合到一个特定的序列基序，并增加染色质的可获得性204,205。在步骤2中，附加的特定于序列的TFs绑定在pioneer factor206附近。核心启动子招募一般TFs (GTFs)和RNA聚合酶II (Pol II)形成预启动复合物(PIC)207。在步骤3中，GTF TFIIH展开DNA, Pol II启动转录208,209。在步骤4,抄录20核苷酸后,波尔二世经历promoter-proximal暂停,暂停是稳定的绑定5,6-dichloro-1-β-D-ribofuranosylbenzimidazole sensitivity-inducing因子(DSIF)和负伸长因子(NELF) complex19, 20日,21日。在暂停之前或暂停期间，Pol II的c端结构域在Ser5位点磷酸化(参考文献210)，RNA经过5 ' capping28。在步骤5中,波尔二世逃promoter-proximal暂停,进入生产伸长,很大程度上由于P-TEFb(包括细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK9) 9日)磷酸化的多个目标:包括NELF(结束其与波尔II)交互,DSIF(将它转换成一个伸长的因素),和波尔II Ser2(与RNA加工因素)22。图中没有显示的其他延伸因子，如聚合酶相关因子1 (PAF1)，促进了这种逃逸。在步骤6中，在生产延伸过程中，多个延伸因子(未显示)增强了Pol II211,212的加工性。共转录过程包括剪接、RNA甲基化和RNA编辑。核小体在高转录基因中被移除，染色质可接近性在中等转录基因213,214处增加。在步骤7中，RNA被裂解并聚腺苷酸延迟23。裂解后，Pol II继续伸长，但新生RNA缺少cap，受5 ' -3 ' exoribonucuclease 2 (XRN2)介导的降解影响，破坏了Pol II的稳定性，有助于终止24。终止后，Pol II可被回收，开始新一轮的转录周期25。
图2 |新生RNA富集与测序方法的比较。图中显示了使用不同的新生RNA测序方法生成的转录谱，这些方法分别针对一个高表达基因(ACTB)、一个高暂停基因(MED17)和一个邻近增强子RNA (eRNA)的基因(用于小鼠细胞的Klf4);IPO7用于人类细胞，它还包含一个内含子内的小核仁RNA (snoRNA) SNORA23。在色谱相关RNA (caRNA)方法中，采用高盐洗涤分离色谱结合RNA。在传统的caRNA测序(caRNA-seq)中，分离材料直接测序。在Start-seq中，分离出的物质被进一步富集，形成帽状rna，大小的选择被用于捕获单个转录本的起始和暂停位点。caRNA-seq数据参考文献41,Start-seq数据参考文献17。在哺乳动物原生拉长转录序列(mNET-seq)中，RNA聚合酶II (Pol II)复合物的免疫沉淀(IP)丰富了与Pol II相关的RNA。抗体介导的Pol II的分离去除了大部分的染色质结合rna。以总Pol II为靶点的mNET-seq的数据来自ref64。c |运行技术用标记的核苷酸标记新生rna。在运行反应中使用阴离子洗涤剂sarkosyl会释放暂停的聚合酶，但不会逆转或终止Pol II。最初的全基因组核运行测序(groo -seq)已被用于提供参与的Pol II在新生RNA上位置的单核苷酸分辨率(precision runon sequencing, PRO-seq)。使用帽子选择和测序从5 '端标记RNA报告启动基(精确运行与帽子选择(PRO-cap))。PRO-cap数据参考文献215 (GSE110638)， PRO-seq数据参考文献4。在代谢RNA标记方法中，活细胞具有修饰过的核糖核苷酸(如4-硫代嘌呤(4sU))，这些核苷酸将被合并到新生RNA中。标记后，新生RNA可以通过亲和纯化(瞬时转录组测序(TT-seq))从总RNA池中富集。另外，4sU允许uto - c碱基转换，用于测序后基于突变的新生转录本识别(TimeLapse-seq)。TT-seq数据参考文献216,TimeLapse-seq数据参考文献46。描述的基因组坐标如下:ACTB (mm9: chr5:143,662,795-143,670,430;hg19: chr7:5,564,780 - 5572230;hg38: chr7:5,525,230-5,532,710)， MED17 (mm9: chr9:15,063,100-15,086,100;hg19: chr11:93,509,600 - 93550000;hg38: chr11:9378,500 -9,479,500;hg38: chr11:9,349,000-9,454,500)和Klf4 (mm9: chr4:55,479,000-55,567,000)。之所以选择IPO7上游的增强子，是因为它在人类细胞s217和染色质IP中广泛转录，然后测序(ChIP-seq)数据表明，在比较的细胞系中，该增强子中存在类似水平的Pol II (GSE83777和ref.218)。LCL，淋巴母细胞样细胞系;lncRNA，长链非编码RNA;小鼠胚胎干细胞;国家结核控制规划,5′核苷三磷酸。
图3 | 新生RNA的成像。在固定细胞中，荧光原位杂交可以检测到新生的| rna。染料标记的DNA探针，是互补RNA杂交到转录的内含子序列，并允许检测内源性新生转录本。DNA - rna杂化比DNA - DNA杂化更稳定，因此这些实验是在DNA探针和互补DNA序列发生变性相互作用的条件下进行的。结合gfp标记蛋白MS2的b |发夹形成序列被设计成内含子，可以在体内成像。MS2特异性地与结构RNA结合，而不是DNA，为新生转录提供特异性。DSIF 5 6-dichloro-1-β-D-ribofuranosylbenzimidazole sensitivity-inducing因素;NELF，负伸长因子;Pol II, RNA聚合酶II;TSS，转录起始位点。
图4 |启动子近端停顿干扰转录起始。转录起始位点(TSS)下游暂停RNA聚合酶II (Pol II)(灰色)50个核苷酸(nt)的|结构模型。启动前复合物(PIC)(包含Pol II、中介物和一般转录因子的模型结构)可以与TSS结合，但如果暂停的Pol II更接近TSS，空间位阻将阻止PIC的结合。b |全基因组协同精密运行和测序(CoPRO)数据分析表明，启动子近端暂停发生在TSS的60个nt内。暂停主要发生在一个富气相色谱区的胞嘧啶上游的一个碱基。c |更新的转录周期模型显示，暂停的Pol II阻断PIC的形成。DSIF 5 6-dichloro-1-β-D-ribofuranosylbenzimidazole sensitivity-inducing因素;GTF，一般转录因子;NELF，负伸长因子
图5 | 观察新生RNA数据集的裂解和聚腺苷酸化。基因的3 '端由位于裂解和聚腺苷酸化位点(CPS)上游的聚腺苷酸化信号(PAS)来划分。在典型细胞中，RNA聚合酶II (Pol II)在CPS处积累，这表明延伸率降低。解理后，Pol II继续转录，但当终止发生在终止窗口时，其水平下降。当裂解因子被敲除时，与对照细胞相比，在PAS处积聚的Pol II要少得多，转录终止的时间也较晚。当使用degron系统快速降解5 ' -3 ' exoribonucuclease 2 (XRN2)时，与对照细胞s168相比，CPS处积聚的Pol II略少，终止时间也大大延迟。综上所述，这些结果支持转录终止的鱼雷模型，即XRN2在裂解后向下追逐未屏蔽的新生RNA，从而破坏Pol II的稳定性。DSIF 5 6-dichloro-1-β-D-ribofuranosylbenzimidazole sensitivity-inducing因素。
表1 | 新生RNA方法的优缺点
表2 | 不同转录步骤的方法研究