科研| 厦门大学：在常绿阔叶林中，林下施氮和冠层施氮在不同程度上影响了九节木的碳氮代谢（国人佳作）
编译：太阳味的风，编辑：Emma、江舜尧。
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为了评估氮沉降对森林植物的影响，研究人员进行了许多氮添加实验。然而，这些实验大多未能完全模拟大气氮沉降，因为它们未能评估森林冠层对氮沉降的截留。在这里，我们使用转录组学、蛋白质组学和代谢组学来比较林下加氮（UAN）、冠层加氮（CAN）和对照（Control，不加氮）对九节木（中国南方常绿阔叶林亚热带林下优势植物）叶片碳氮代谢的影响。我们首先通过RNA-seq建立了一个参考的九节木转录组，并从中获得了93986个功能基因。接下来，我们对叶片中的蛋白质组和代谢组进行了研究，鉴定出4021种蛋白质和562种代谢产物。在CAN处理下，与对照相比，共有36个基因上调，23个基因下调，共鉴定出46个上调蛋白和49个下调蛋白。在UAN处理下，与对照相比，共有1525个基因上调，224个基因下调，共鉴定出35个上调蛋白和71个下调蛋白。这些差异表达的基因和蛋白质与光合作用、氨基酸代谢和类黄酮生物合成有关。在对CAN和UAN的处理中分别发现了15个差异累积代谢物，20个差异累积代谢物，这些差异积累代谢物包括4种氨基酸和3种黄酮类化合物。综上所述，我们的结果表明，UAN处理比CAN处理对光合作用、氨基酸代谢和类黄酮生物合成的影响更大。最重要的是，研究结果表明，林下施氮可能错误的评估了九节木和其它林下木本植物对氮沉降的响应。
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实验设计
实验地点位于石门台（中国广东省）自然保护区（北纬24°22′-24°31′，东经113°05′-113°31′）。该地区以亚热带季风气候为主，分为旱季（11月至3月）和雨季（4月至9月）。年平均降雨量2364mm，年平均气温20.8℃。该地区为砖红壤（pH值5.0-5.5），高度风化，碱阳离子浓度低，但铝浓度高。
该地区覆盖着一片具有50年历史的亚热带常绿阔叶林，林分密度约为800棵树每公顷。主要树种为锥栗（Castaneahenryi (Skam) Rehd），木荷（SchimasuperbaGardn. et Champ），罗伞树（Ardisia quinquegona Blume），和鸭脚木（Scheffleraoctophylla (Lour.) Harms）等。
试验最初包括五个处理：1）CAN 50（林冠添加50公斤氮/公顷年），2）UAN 50（林下植被添加50公斤氮/公顷年）和3）Control（不加氮）。
九节木（Psychotria rubra），高0.5～5m，广泛分布于华南和东南亚亚热带阔叶林下层。其叶和根被用作中草药。2018年9月，从每个地块的4-5株植物中选择约5-10株九节木的叶片。在测量光合和叶绿素荧光后，将叶片在液氮中进行速冻，然后保存到-80°C的冰箱中等待分析。
实验结果
我们从Control组的叶片中分别获得了48806498、57866410和61496178个净读数（clean reads）；从CAN组叶片分别获得了63244158、60980208和38451504个净读数；从UAN叶片获得了53038680、43778486和48589428个净读数，使用TGICL软件进行组装。最终注释了48275个（51.3%）的单基因。我们进一步在CAN和Control（CAN/Control）以及UAN和Control（UAN/Control）的比较中总共获取1787 DEGs。在CAN/Control的比较中，我们只确定了59 DEGs，其中36 DEGs上调，23 DEGs下调（图2A）；在UAN/Control的比较中，我们确定了1728 DEGs，其中224 DEGs下调，1525 DEGs上调（图2A）。因此，只有少数DEG基因被分配到KEGG通路进行CAN/Control比较，而在UAN/ Control比较中识别出更多的基因（图2B）。在UAN/Control比较中上调的DEGs中，许多与光合作用有关；例如，分别有21、12和19个DEG分别被分配到“光合作用”、“光合作用天线蛋白”和“光合作用生物体中的碳固定”（图2B）。有趣的是，在UAN/Control比较中，与“二次甲基苯丙酸盐生物合成”、“苯丙酸生物合成”和“代谢途径”相关的基因得到了高表达（图2B）。
总共识别了19969个肽和4021个蛋白质。在CAN/Control之间检测到49个下调蛋白和46个上调蛋白，而在UAN/Control之间检测到71个下调蛋白和35个上调蛋白（图3A）。在CAN/Control比较中，6个DEPs被分配到“吞噬体”，10个DEPs被分配到“蛋白质过程单胞质电学”，3个DEPs被分配到“其他糖和降解”，3个DEPs被分配到“氮代谢”（图3B）。在UAN/Control比较中，DEPs参与了诸如“吞噬体”（7种蛋白质）、“其他糖代谢”（4种蛋白质）、“类黄酮生物合成”（4种蛋白质）、“氨基糖和核苷酸糖代谢”（7种蛋白质）、“苯乙烯类、二芳基庚类和姜糖生物合成”（2种蛋白质）等途径，“半胱氨酸和蛋氨酸代谢”（5种蛋白质），以及“角质、亚角质和蜡生物合成”（1种蛋白质）。
LC-MS/MS共检测到九节木叶片中562种代谢物，主要包括氨基酸、糖、黄酮类、脂质、类脂分子、核苷酸及其衍生物、有机酸及其衍生物。15种代谢物在CAN/Control比较中有定量差异，20种代谢物在UAN/Control比较中有定量差异。在与CAN/Control比较的15种代谢产物中，7种代谢产物显著上调，8种代谢产物显著下调。在与UAN/Control比较的20种代谢产物中，有8种代谢产物上调，12种代谢产物下调（图4A）。通过热图显示代谢差异（图4B）。“次级代谢产物的生物合成”、“氨基酸生物合成”、“黄酮和黄酮醇生物合成”、“D-精氨酸和多硝基代谢”和“黄酮生物合成”在UAN/Control比较中高度呈现，但在CAN/Control比较中没有显著富集通路。
许多与光反应和卡尔文循环（Calvin cycle）相关的基因在CAN/Control之间没有表现出差异表达，但是在UAN处理组中相对于Control显著上调（图5A）。例如，光系统I（PSI）反应中心亚单位、光系统II（PSII）反应中心蛋白、叶绿素a/b结合蛋白和光合电子传递的DEGs的表达在UAN/Control对比后上调（图5A）。正如预期的那样，卡尔文循环中的7 个DEGs显示出与光反应相似的表达（图5B）。以下基因的表达因UAN处理而显著增加：3个核酮糖二磷酸羧化酶小链基因（Unigene0037957、Unigene0037958和Unigene0037959）、2个核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶激活酶基因（Unigene0030983和Unigene0030984）、1个果糖二磷酸醛缩酶基因（FBA，Unigene0090625）和1个磷酸IBulokinase基因（PRK， Unigene0092900）。
CAN或UAN处理下，叶片中至少25个与氨基酸代谢有关的基因表达与对照相比存在显著差异。如热图所示，大量氨基酸代谢基因在UAN处理后显著上调，但只有4个基因在CAN处理后上调（图6）。然而，只有两个基因（Unigene0056788和Unigene0047223）在对CAN的反应中下调，另外两个基因（Unigene0016293和Unigene0042065）在对UAN处理的反应中下调（图6）。出乎意料的是，Unigene0042065编码谷胱甘肽转移酶，在CAN处理下上调，而在UAN处理下下调（图6）。这些结果表明，在不同的处理中，添加氮对九节木叶片氨基酸代谢基因表达的影响是不同的。然后我们对氨基酸进行代谢分析。代谢分析检测到24种游离氨基酸和47种氨基酸衍生物。其中，两种氨基酸L-鸟氨酸和L-天冬酰胺在UAN处理中比对照处理中含量更丰富，L-组氨酸在UAN处理中明显少于对照处理。
参与类黄酮生物合成的基因表达受UAN处理后下调，但不受CAN处理的影响。在UAN处理下，编码查尔酮合酶（花青素生物合成中的限速酶）的CHS和编码花青素还原酶（花青素生物合成途径中花青素代谢的一个组成部分）的表达分别比对照组低7.5倍和13.5倍。正如预期的那样，被分配到“类黄酮生物合成”的四个DEP（CHS、查尔酮异构酶、莽草酸-羟基肉桂酰转移酶和咖啡酰辅酶A O-甲基转移酶）被UAN处理下调（图7）。与对照组相比，通过CAN处理，CHS上调，莽草酸O-羟基肉桂酰转移酶下调（图7）。代谢分析检测到九节木叶中含有47种黄酮类化合物。UAN处理只降低了芹菜素7-O-葡萄糖苷和槲皮素的含量，而UAN处理对主要类黄酮没有显著影响。出乎意料的是，基于蛋白质组数据的CAN处理增加了CHS含量（图6），但CHS产物查尔酮的含量降低了。
结论
目前的研究表明，传统的施氮实验方法，可能不正确地反映了氮沉积对生理学、药用成分的影响，并可能影响主要林下植物的生长。虽然仅基于一个采样日期，但当前研究的结果与我们在此研究地点之前的观察结果一致。常绿阔叶林是我国重要的生态系统，主要分布在我国经济发达地区，氮沉降速率特别高。这些森林茂密的树冠为林下物种提供了重要的保护屏障。结果表明，林冠截留氮沉降可以减少进入林下和土壤的氮量，从而降低氮沉降对磷的代谢和植物化学成分的影响。
评论
正如作者所说，常绿阔叶林的高大树冠为氮沉降提供了“阻碍”。显然，文中的两种施肥方式对叶片的代谢造成了显著性差异，但为何会产生这种差异值得进一步探讨，例如：树冠施氮是否可能导致氮素直接附着在叶片上，叶片的营养更为充足，因此才导致多种微生态差异？