科研 | Neuron：脑组织深度蛋白组学鉴定阿尔茨海默病进展中的分子网络
编译：文文，编辑：Emma、江舜尧。
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蛋白质组学技术及其它组学技术的飞速发展，为临床疾病的机制研究和诊断标志物的发现提供了前所未有的机遇，高通量蛋白质测序可以在临床生物标本中准确检测出上万个蛋白及其分子修饰。系统生物学可以在这些数据中分析出其中差异性表达的蛋白及修饰以及相应的信号通路及关键分子，从而为疾病机制和诊断标志物的发现提供重要线索。阿尔茨海默病（AD）是最常见的老年痴呆病，目前全球AD患者估计高达5千万，随着人口老龄化此类患者会迅速增加，并将带来日趋严重的社会问题。然而目前AD的治疗效果有限，最近几年的重大治疗方案在临床III期试验中几乎均告失败。现有的主要假说认为Aβ在AD发病中起原发性作用，而Tau蛋白则介导了最终的发病过程，但它不能解释AD发病中的很多问题。另外，由于该疾病主要是由神经元的大量不可逆性死亡引起，并且神经元无法再生，因此控制它的关键在于早期发现及干预，而这迫切需要发现新的分子机制和诊断标志物。2020年1月8日，彭隽敏教授团队在Neuron杂志上发表文章相关文章，利用基于质谱（MS）的蛋白质组学及系统生物学研究为阿尔茨海默病的发病机制和临床诊断提供新的分子线索。
论文ID
实验设计
人脑组织（n=90）—基于MS的蛋白质组学分析—AD小鼠模型验证—多组学集成优化—靶标验证
实验结果
1. AD进展的深层蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学研究
研究人员开发了一个三阶段策略来发现、验证并集成多组学AD数据(图1A)。从100例人额叶皮质样本中选择了90个高质量样本，并划分为5个组别：（1）LPCs（对照组）：老年斑和神经原纤维缠结程度较低；（2）HPCs（对照组）：Aβ病理学高但无明显认知缺陷；（3）MCI（实验组）：Aβ病理程度轻微其具有轻度认知损伤；（4）AD（实验组）：晚期AD伴老年斑和神经原纤维缠结程度较高；（5）PSP（实验组）：另一种神经退行性Tau病—进行性核上性麻痹。研究人员对这些额叶皮质样本进行了深度TMT蛋白组学分析，一共鉴定到了14513个蛋白（图1B）。蛋白组学分析中，共获得173个差异蛋白，Aβ蛋白水平与病理结果基本一致（图1E）。聚类分析(图1D)、主成分分析和相关性分析进一步支持了数据的可靠性。随后采用加权基因共表达网络分析对差异蛋白进行聚类、采用互作网络分析以及通路分析来解析蛋白组的表达规律以及分子网络变化特征，分析鉴定出3个完整蛋白质组簇(WPC)及其富集途径(图1F和G)，将每个WPC模式中的差异蛋白与PPI网络整合起来定义了11个功能模块(图1H)，并使用WB对变化的蛋白质进行了数据验证(图1I)。此外还采用TMT蛋白组学在两个新的队列Banner Sun（n=49）以及Mount Sinai (n=80)中进行验证：有58个差异蛋白在两个队列中均得到了验证（图2A-D），两个广泛的TMT验证分析有力表明了深入蛋白质组学研究的重复性。为进一步验证脑组织检测到的差异蛋白质可否作为脑脊液（CSF）中潜在的疾病标记物应用于临床，研究人员在Banner Sun队列里选择了18个CSF样本再次进行蛋白质组学分析（图2E）。结果显示，有8种蛋白在脑组织和CSF中变化一致（图2F）。其中4种已有报道，其余的4种蛋白（SLC39A12、SLC5A3、SLIT2和STEAP3）可以作为新的候选生物标志物。
图1 AD进展的全蛋白质组图谱揭示了疾病期依赖的蛋白质和/或通路
（A）阿尔茨海默病患者和5xFAD小鼠模型的蛋白质组和磷酸蛋白质组的多层图谱分析策略和多组学数据集成；（B）5组人脑组织的分析概况，每组包含2个独立的分析，每个分析包含9个病例样本；（C）MS数据显示各组Aβ水平，显示了一种Aβ胰蛋白酶肽（LVFFAEDVGSNK）的相对TMT强度；（D）基于变化蛋白的蛋白质组学数据集的聚类分析，彩色标尺表示5个疾病组(列)上每个蛋白质(行)的TMT强度；（E）识别差异表达蛋白的生物信息学流程；（F）WGCNA定义的差异蛋白的3个主要簇(WPC1-WPC3)，每条线代表一种蛋白质，每种蛋白质强度进行log2Z分数转换，线条颜色表示每个蛋白质与簇的特征值之间的模式相关程度；（G）Fisher’s精确检验显示WPC蛋白中的富集途径；（H）在WPC中检测到PPI模块；（I）Western blotting验证所选差异表达蛋白。
图2 通过分析Banner Sun和Mount Sinai队列中的个体人类样本来验证AD相关蛋白
（A）Banner Sun个人队列分析；（B）Mount Sinai队列分析人类样本，剔除异常值后有23例对照和39例AD患者；（C）通过来自两个队列的个体病例验证差异表达蛋白的生物信息学流程；（D）在三个数据集中(Banner Sun汇集样本、Banner Sun个体样本和Mount Sinai个体样本)中验证差异表达蛋白；（E）Banner Sun队列CSF样本分析，剔除异常值后有5例对照组和8例AD患者；（F）AD患者脑组织和CSF中8种蛋白质的改变。
2. 磷酸化组学数据分析AD中的激酶活性
TMT磷酸化蛋白组分析一共鉴定了7083个蛋白上的34173个磷酸位点，其中有来自398个蛋白的873个磷酸化肽段差异表达。微管相关蛋白Tau在AD组中的磷酸修饰水平最高(图3A)。聚类分析(图3C)、主成分分析和相关性分析进一步支持了数据的重复性，聚类分析结果也显示出AD组的磷酸化蛋白质组变化最为剧烈。将873个差异磷酸肽(398个蛋白质；图3D)鉴定为四个主要的磷酸肽簇PPC1-PPC4 (图3E)，PPC1-PPC4模式表明蛋白质磷酸化是高度动态的，并在AD的不同阶段进行主动重塑。检查了在每种PPC模式中富集的磷酸化蛋白通路，揭示了AD中剪接功能障碍和钙假说2种新的通路(图3F)，还在差异蛋白质组和差异磷酸化蛋白质组中发现11个重叠的蛋白质(图3G)。
接下来，研究人员利用IKAP机器学习算法推断出186种激酶的活性，其中28种可能发生变化，主要发生在AD组(图3H)。该列表基本上涵盖了所有已知的Tau激酶。最终，研究人员在蛋白质组和磷酸蛋白质组分析了这28个激酶及其相关家族成员的表达水平。尽管绝大多数激酶（除了MAP3K6）在蛋白质水平上没有变化，但MAPK级联通路中表现出明显的磷酸化修饰水平上调，包括：MAP4K、MAP3K、MAP2K和MAPK。MAPK信号负调节因子DUSP6在AD组中显著降低(图3K)。这些结果验证了前人的研究结论：MAP激酶信号的激活与AD的发病机制有关。
图3 AD患者蛋白质磷酸化的特征分析
（A）MS测定Tau磷酸化，显示5种疾病组中磷酸化Tau肽的相对TMT强度；（B）磷化丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸在鉴定的磷酸盐中的分布；（C）人体样本中改变的磷酸肽的聚类分析，5个疾病组(列)的磷酸肽(行)的TMT强度用彩色标尺表示；（D）用于鉴定差异表达磷酸肽、聚类分析和激酶活性分析的生物信息学流程；（E）WGCNA分析差异表达磷酸肽的4个主要磷酸化蛋白组簇PPC1-PPC4，每条线代表一个磷酸肽，线条颜色表示每个磷酸肽与簇的特征值之间的模式相关程度；（F）Fisher’s精确检验显示PPC蛋白之间的富集途径；（G）差异表达蛋白质组和磷酸化蛋白质组之间的重叠；（H）IKAP算法从相关底物计算激酶活性；（I）4组AD样品中CDK5激酶家族底物磷酸化水平；（J）4组AD样本中GSK3激酶家族底物磷酸化水平；（K）基于对整个蛋白质组和磷酸化蛋白质组的MS测量的MAPK通路的潜在活性。
3. Aβ相关蛋白的改变以及人和小鼠的比较
为了探讨Aβ积累引起的分子事件，研究人员在Banner Sun和Mount Sinai队列的蛋白质组结果中特别关注了28个Aβ相关的差异蛋白(图4A-C)。随后对5xFAD和野生型（WT）小鼠（3、6和12个月龄）皮层组织进行TMT蛋白质组分析发现，28种Aβ相关的差异蛋白中有23种在小鼠中被鉴定到，15种持续增加，其中4种与RNA上调相关，这表明5xFAD小鼠中大多数Aβ相关蛋白受转录后机制调控(图4D和E)。
将小鼠差异蛋白质（5xFAD/WT）与人类组织差异蛋白质（HPC/LPC、MCI/LPC和AD/LPC）进行对比，结果表明：5xFAD表现出与AD晚期相似的蛋白质组特征，但表现出自噬和干扰素反应的激活，并且缺乏人类特有的有害事件，例如神经营养因子和突触蛋白的下调(图5A-C)。因此在人类和小鼠的病理条件下，物种特异性差异表达蛋白可能经历不同程度的蛋白质组重构。
图4 AD与5xFAD小鼠模型中Aβ相关蛋白的研究
（A)基于胰蛋白酶多肽(红色)的MS测定Aβ；（B）121例人体标本中Aβ与差异表达蛋白的相关性分析，用Pearson相关系数和对应的p值来评估相关程度；（C）NTN1/Netrin-1(一个例子蛋白)与Aβ之间良好的相关性；（D）5xFAD小鼠(3、6和12月龄)的全蛋白质组分析；（E）在5xFAD小鼠中验证人类Aβ相关蛋白。
图5 人-鼠蛋白质组学比较
（A）人类病例和5xFAD小鼠的全蛋白质组比较，每个点代表一个蛋白质，颜色表示点密度，变化一致的蛋白质显示在右上角和左下角并由红色分界线分隔；（B）人类特异差异表达蛋白富集途径的例子；（C）5xFAD特异性差异表达蛋白激活途径的例子。
4．淀粉样斑块病理学进程中的重要通路和蛋白排序
在这项研究中，研究人员以系统生物学的理念整合了主要维度的7个AD数据集（MCI蛋白质组、AD蛋白质组、磷酸蛋白质组、聚集蛋白质组；全基因组关联分析；转录组；蛋白相作组），使用顺序统计和基因集富集分析（GSEA）对基因和/或蛋白质和途径进行等级排序(图6A)。蛋白排序中，APP、APOE和MAPT为前3位，与目前对AD发病机制的理解一致(图6B)。GSEA对信号通路进行了优先排序，确定了16条通路，共分为4大类：淀粉样蛋白和Tau通路、炎症、生长发育以及代谢和膜转运(图6C)。此外，亚细胞定位分析表明，在AD中，分泌子体和细胞表面子体受到特别的干扰，可能对细胞通讯产生强烈的影响(图6D)。
然后检查了排名较高的Aβ相关蛋白是否与淀粉样斑块病理有关。免疫组化实验、免疫荧光分析和亲和结合实验结果表明：4种Aβ相关蛋白（MDK、NTN1、SMOC1和ICAM1）与Aβ40淀粉样斑块共定位，MDK和NTN1显示直接的Aβ结合，暗示它们可能在AD脑中共同发挥作用(图7A-G)。
图6 多组学方法确定AD中蛋白质和/或基因的优先顺序
（A）对蛋白质和路径进行排序的策略，首先用综合顺序统计量对蛋白质进行排序，然后用GSEA对其进行路径排序；（B）通过组合7个数据集得出评级次序表；（C）GSEA富集途径，分为4组，条形码图显示出蛋白质在排序等级上的位置；（D）亚细胞定位富集蛋白质。
图7 AD和5xFAD中选定蛋白靶点的特征
（A）对照组和AD患者脑切片(额叶皮质)的免疫组化染色；（B）免疫荧光标记AD脑切片中选定的蛋白质(红色)、Aβ(绿色)和细胞核(DAPI为蓝色)；（C）所选蛋白在WT和5xFAD小鼠(12月龄)中的免疫组化染色；（D）免疫荧光标记5xFAD皮层(12月龄)中选定的蛋白质(红色)、Aβ(绿色)和细胞核(DAPI为蓝色)；（E）WT和5xFAD样本(12月龄，海马)的Western blotting；（F）Aβ40和人重组蛋白的银染。
结论
本研究通过利用MS技术深度分析了人脑组织的蛋白质组与磷酸化修饰蛋白组用以表征AD进展阶段相关的分子网络特点，获得了参与17个途径的173个差异蛋白，随后在两个独立的队列中验证了差异蛋白质的变化，并在CSF样本中再次利用蛋白组学策略进行验证，筛选获得了新的候选生物标志物。结合小鼠模型分析，研究人员确定了人和小鼠均呈现差异的15个Aβ相关蛋白。5xFAD小鼠模型表现出与症状性AD相似的蛋白质组特征，但存在自噬和干扰素反应的激活并且缺乏人类特有的有害事件。在多组学整合中，优先考虑了与AD相关的蛋白和途径，包括淀粉样级联、炎症、补体、WNT信号、TGF-β和BMP信号、脂质代谢、铁稳态和膜转运，后续验证结果显示4种Aβ相关蛋白与淀粉样斑块共定位，这也说明了多个组学整合分析策略可用于在AD进展过程识别蛋白质分子网络。
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