科研 | Microbiome：用体外和体内模型探究磷虾油减轻肠道炎症和调节肠道微生物的机制
编译：琳儿，编辑：Emma、江舜尧。
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磷虾油（KO）是一种富含ω-3多不饱和脂肪酸（PUFA）的潜在抗氧化天然产物。本试验利用体外和体内结肠炎模型及多组学研究方法对KO调节肠道微生物和代谢组的机制进行了研究。研究结果显示，KO可呈剂量依赖性显著降低LPS诱导的人巨噬细胞IL-1β和TNF-α的分泌，调节过程涉及NF-κB和NOD-样受体信号通路，并在缓解炎症途径中与COX2和IKK2抑制剂具有协同作用。此外，KO通过促进M2极化和增强巨噬细胞介导的细胞内细菌杀伤而参与炎症的解决。通过饲喂KO可部分恢复猪毛首线虫（Trichuris suis）感染引起的猪寄生虫依赖性肠黏膜损伤和微生物紊乱。KO的补充降低了立克次体（Rickettsiales）和几种乳酸杆菌（Lactobacillus）丰度，这是通过随机森林分析确定的有助于KO添加分类精准性重要特征之一。确定了几个对感染和补充具有强预测能力的微生物特征。采用非靶向代谢组学方法鉴定KO对组氨酸代谢的抑制作用。通过抑制结肠粘膜中编码L-组氨酸脱羧酶基因的表达，和减少微生物来源的组胺生物合成，补充KO降低了与组氨酸代谢相关的几种关键代谢物。此外，利用柠檬酸杆菌（Citrobacterrodentium）诱导的Th1依赖性结肠炎小鼠模型，验证了KO的促分解特性。此外，鉴定出小鼠结肠炎相关病理生理特征中具有高预测准确性的微生物特征。该研究结果为优化IBD治疗中微生物启发的替代疗法提供了机制基础。鉴定出的微生物特征，尤其是那些对结肠炎表型有强预测准确性的微生物特征，将有助于促进与适当饮食干预以控制肠道炎症的相关的生物标志物的开发。
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实验设计
1. 细胞培养
用佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯（PMA）对THP1单核细胞进行分化。台盼蓝染料测定不同剂量水平的KO细胞毒性。将化合物添加到培养基中总共48h，分组为：KO（160 μg/ml）、20 μM塞来昔布、1 μM TPCA1、KO+塞来昔布（KC）和KO+TPCA1（KT）。42小时后，将LPS以10 ng/ml的终浓度加入培养基中6 h，等体积的PBS作对照（NC）。培养基用于ELISA分析，收集细胞分离总RNA。
用庆大霉素保护试验评价KO对巨噬细胞吞噬和杀菌活性的影响。PMA分化的THP1细胞在含有KO（160 μg/ml）或PBS（阴性对照）的培养基中培养48 h。然后用无抗生素培养基清洗细胞，并在37℃下以10:1的感染倍数感染C.rodentium 60分钟（T0）。感染后，用冷PBS冲洗细胞三次，并用含庆大霉素的培养基（100 mg/ml）培养2 h（T1）。每个时间点细胞用无菌PBS冲洗三次，在0.2 ml无菌细胞溶解缓冲液中溶解。将裂解物与0.8 ml无菌PBS混合；连续稀释液铺板，并在37℃孵育过夜后计数。重复四次测定。计算细胞内细菌杀灭率。
2. Citrobacterrodentium培养
复苏C. rodentium，液体扩增生长至OD600约1.5。离心收集菌体，重悬于LB。通过在LB琼脂平板上平板接种50 μg/ml萘啶酸进行选择来确定组织中的C. rodentium负载。
3. 动物及食物
40只猪，9-10周龄，自由进食和饲养，随机分为四组，寄生鞭虫T. suis感染为第一因子，饮食治疗为第二因子。四组（每组10只），分为（1）未感染喂食大豆油（SO），（2）感染喂食大豆油（SO），（3）未感染喂食KO，（4）感染喂食KO。20头感染猪接受单剂量口服5000只感染性猪瘟卵，而20头未感染猪PBS处理。接种后21天感染继续进行。SO和KO饮食治疗在感染卵接种前7天开始，共28天。每天早晨，将1.5克SO或KO分别混合在新鲜制成的糖衣饼干面团球中。
利用30只5周龄的C3H/HeNCr雄性小鼠，整个实验过程饲喂基础AIN-93M饲料。两周后，将小鼠随机分为三组（每组N = 10）：未感染并补充PBS（NC），感染了C.rodentium并补充了PBS（CM），以及感染了C.rodentium并补充了KO。适应后，CM组和KO组小鼠经口灌胃感染C.rodentium，2.5×109cfu/0.2 ml。未感染小鼠经口灌胃0.2 ml无菌PBS。接种后12天继续感染。NC组和CM组小鼠在感染前5天口服0.2 mL PBS，KO组小鼠在感染前5天口服0.2 mL KO水包乳剂（1.5mg KO/只），持续至实验结束（共17天）。接种后不同时间点收集粪便，并测定粪便中C. rodentium的量。感染后第12天，将小鼠称重并安乐死。无菌取出脾脏组织，称重，LB中匀浆，在无抗生素的LB琼脂平板上铺板以计数总细菌量。切除整个结肠并测量长度。收集包括粪便沉淀在内的整个结肠内容物，混合，并在液氮中速冻，进行代谢物谱分析和微生物组分析。一部分进行组织学检查，一部分提取总RNA进行RNAseq转录组分析。在LB中将与肛门相邻的结肠部分匀浆以测定细菌负荷，以log10 cfu/g结肠组织表示。
4. 代谢组学分析
使用1290 Infinity II液相色谱系统与带有电喷雾离子源（ESI）的Sciex 4000 QTRAP质谱仪（MS）联用测定肠结肠内容物中的短链、中链和长链脂肪酸。使用负离子检测，以多重反应监测模式分析脂质。
实验结果
1．磷虾油在体外通过调节广泛的信号通路来减轻炎症
KO处理分化的THP1人巨噬细胞以剂量依赖性方式显着降低脂多糖（LPS）诱导的IL1β和TNFα mRNA表达（图1a, b）。320 μg/ml KO孵育72 h没有检测到细胞毒性（图1c）。用160 μg/ml KO可使LPS诱导的IL1β和TNFα mRNA水平降低约53%（p < 0.01）。利用转录组测序研究KO与两个抗炎化合物，塞来昔布（celecoxib，COX2抑制剂，CX）和TPCA1（IKK2抑制剂）的协同作用。KO与CX或TPCA1联用比KO单用更好地降低促炎基因的表达，如IL6，NOD2和CCL2（图1b–g）。
图1 磷虾油（KO）单用或与COX2和IKK2抑制剂联用对LPS处理的人分化THP-1细胞促炎细胞因子和转录组的影响
KO降低LPS诱导IL1β（a）和TNFα（b）mRNA水平呈剂量依赖性。（c）不同KO剂量孵育24，48和72h后活细胞数量。直到320μg/ml KO剂量仍无细胞毒性。（d）样本标签。160 μg/ml KO显示出在抑制炎症介质如IL6（e），NOD2（f），和CCL2（g）的协同作用。h利用RNAseq转录组分析差异表达基因显著富集的通路。（i）热图显示了受KO和COX与IKK2单用或联用调节的PPAR信号通路中基因。***p < 0.001; **p< 0.01; *p < 0.05. ###p < 0.001 (LPS vs. NC)
KO单用或与celecoxib和TPCA1联用，可抑制多个巨噬细胞LPS活化途径。Toll样受体和TNF信号通路显著富集（FDR < 0.001；图1h）。多个与过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR）信号通路相关基因经LPS处理显著下调（FDR < 0.05），但KO单用或与celecoxib和TPCA1联用可上调这些基因的表达（图1i）。此外，LPS上调许多M1型巨噬细胞标志物基因，如CCL2，IL12B，CXCL9，CXCL10，CXCL11和CD80，KO处理48 h可以逆转这些促炎M1型基因的表达（图2）。KO还使得LPS抑制的M2型巨噬细胞标志物基因表达恢复正常水平（图2a–e）。这些发现说明KO或许可以促进人巨噬细胞由M1型向M2型极化。
KO对THP1人巨噬细胞吞噬作用和胞内细菌杀伤作用也进行了评估。KO显著增加了巨噬细胞介导的胞内细菌杀伤作用（p = 0.0176），显示为经杀伤后的存活的细菌细胞显著减少（图2f）。体外试验提供了证据，表明KO在炎症的初期和缓解前阶段均有调节作用，或许对促进黏膜愈合有效果。
图2 KO增加巨噬细胞胞内细菌杀伤能力，并调节体外巨噬细胞不同标记物的基因表达
（a）与单核细胞分化相关的基因和基因功能注释。（b） KO逆转LPS对M1型巨噬细胞相关标志物基因的影响。（c） KO上调M2型巨噬细胞活化相关基因。（d）KO和COX2与IKK2抑制剂单用或联用显著抑制LPS诱导的IL12B（d）和CXCL10（e）表达。（f）由于庆大霉素保护试验中存活的细菌数量显著减少，KO增强了Citrobacter rodentium的细胞内杀伤作用。***p < 0.001; **p < 0.01; ###p < 0.001(LPS vs. NC)
2．磷虾油减轻Th2驱动的猪结肠炎模型中肠道黏膜损伤
Th1/Th2/Th17失衡是结肠炎发病的重要驱动力。近年来发现重新平衡Th1/Th2免疫应答可改善DSS诱导的结肠炎。体外试验已发现KO抑制Th1免疫应答，并出现促进M1/M2巨噬细胞极化的作用，促使研究人员利用Th2诱导的猪结肠炎模型以观察KO的抗炎特性以及在促进炎症消退中的作用。通过HE染色可以看出补充KO28天可以改善T.suis感染诱导的结肠病理性损伤（图3a）。感染导致隐窝长度显著增加，由正常对照组387.60 ± 40.86的增加至539.90 ± 113.38 μm（p= 0.0004）。补充KO部分逆转了感染导致的隐窝长度增加，结肠长度至（464.00 ± 67.16, p = 0.043）（图3b）。KO对结肠平滑肌厚度和总组织病理学评分稍有改善（图3c）。KO显著增加杯状细胞数量，尤其是在未感染动物中（图3d）。
图3 补充KO对猪结肠组织病理学评分的影响
SC：饲喂大豆油（SO）的未感染猪，SI：饲喂SO的感染猪，KC：饲喂KO的未感染猪，KI：饲喂KO的感染猪。（a）近端结肠全形态学。（b）隐窝长度。（c）总病理学评分。（d）阿尔辛蓝和高碘酸希夫碱染色杯状细胞。**p < 0.01; *p < 0.05
3．磷虾油部分恢复了Trichuris suis诱导的肠道微生物紊乱
Trichuris显著降低猪alpha多样性指数（图4a），饲喂猪KO显著增加了两个丰度指数（图4b）。无论感染情况如何（p = 0.0172），Chao1指数在饲喂猪KO后从1557.36 (± 242.78;SD)增加到1702.13 (±167.95)。系统发育多样性wholetree也被KO从63.86增加到68.23 (p = 0.0439)。KO补充对物种均匀度没有影响，例如Shannon和Simpson指数。但感染对肠道微生物的多样性产生了影响，导致OTU，PD whole tree，香农和辛普森的指数显着减少（p <0.01，图4a）。不像饮食补充，感染对beta多样性也有显著影响（图4c）。排列多变量方差分析（PERMANOVA）的结果表明，肠道微生物组成的14.7%的变异可以解释为感染的影响（基于排列的p=0.0001），而KO因子只能解释2.4%的变异。感染与饮食补充之间没有显着的相互作用。基于Jensen Shannon散度的非度量尺寸缩放（NMDS）分析（图4c，d）也支持以下假设：影响肠道微生物组成和结构的主要因素是感染状态。感染诱导的微生物紊乱之一的标志是Firmicutes与Bacteroidetes比例（F/B）。在添加SO或KO的背景下，感染导致Firmicutes门的丰度显着下降，而拟杆菌的数量随之增加。但是，KO显着改善了与感染相关的F B比例降低（图4e，p <0.05）。
图4 磷虾油调节猪模型肠道微生物
（a）与未感染的猪相比，Trichuris suis感染对各种微生物α多样性指数有显着影响。（b）相对于饲喂豆油（SO）的对照猪，补充磷虾油（KO）可以增加猪近端结肠中微生物的丰富度。（c）感染（c）和补充（d）对肠道β多样性的影响，如基于Jensen-Shannon散度的距离矩阵的非度量多维标度（NMDS）所示。（e） KO对近端结肠微生物组中厚壁菌与拟杆菌的比率有重要影响。
微生物组组成分析（ANCOM）显示，在补充KO后，立克次体目（Rickettsiales）未分类属的相对丰度显著降低（图5a）。在种水平上，在喂食KO的猪中，阴道乳杆菌（Lactobacillus vaginalis）的丰度也显著降低了约3倍（图5b）。此外，在26个OTU中，至少有三个OTU，即Greengenes(GG) #355089 (r = -0.5467, p < 0.05)，GG#4416659(r = − 0.5414, p <0.05)和GG#588197 (r = − 0.5134, p< 0.05)是在感染状态下与KO呈负相关的，被归入乳杆菌属（图5c）。随机森林（RF）选择的20个最重要的属提供了KO和SO组之间的准确分类（图5d）。使用selbal可以准确预测出未感染组的微生物特征或平衡性。这种平衡由两个属组成，即考拉杆菌属（Phascolarctobacterium）和脱硫弧菌科（Desulfovibrionaceae）中的一个未分类属，作为分子，而费氏杆菌（Faecalibacterium）属作为分母，在感染状态的受试工作特征曲线（AUC）下的面积为0.953（平均交叉验证或CV-AUC = 0.78）（图5e）。感染组的平衡值为负，表明分子中的两个属的丰度比分母费氏杆菌（Faecalibacterium）的丰度低得多。此外，由Proteobacteria门中的两个属组成的平衡，包括分子Rickettsiales中的未分类属和分母Deltaproteobacteria中的未分类属，对KO补充具有很高的预测准确性（AUC = 0.812，图5f）。KO组的平衡比SO低得多，这表明KO降低立克次氏体（Rickettsiales）中未分类属的相对丰度在模型性能中起重要作用，并且可能具有关键的功能相关性。在将感染视为协变量的同时，又增加了一个新的平衡，即在最初的两个属中分别增加了两个属，即克罗诺杆菌（Cronobacter）和梭状芽胞杆菌（[Clostridium]）作为分子和分母，从而提高了膳食补充剂的预测准确性（AUC = 0.892）。
图5 重要的微生物分类群与猪的感染和补充状况有关
（a）磷虾油（KO）显着降低了Rickettsiales（a）和Lactobacillus vaginalis（b）的未分类属的丰度。（c）选择在感染条件下显示与KO补充有显着相关性的OTU。GG＃代表Greengenes ID。（d）由随机森林分类模型排名的重要属有助于提高有关KO状况的分类准确性。（e）selbal选择的微生物特征或总体平衡具有很高的准确度，以区分感染（e）和KO补充状态（f）。ROC（受试工作特性）曲线下的AUC面积。箱形图表示每个类别的平衡值的分布。图的右侧（垂直）面板代表每个类别的ROC曲线，以及AUC值（顶部）和密度曲线（底部）。** p <0.01；* p <0.05
4．磷虾油对组氨酸代谢的抑制作用有助于其抗炎活性
从KO喂养猪的预测数据来看，组氨酸代谢途径发生了改变，因此研究使用非靶向代谢组学分析来证实KO对组胺的抑制作用。如图6a所示，组氨酸分别被L-组氨酸脱羧酶（HDC）和组氨酸氨裂合酶（HAL）降解为组胺和尿酸。给猪饲喂KO显著降低了感染引起的肠道组胺水平的升高。感染引起的肠腔组胺增加可能是由于宿主和微生物来源的组胺生物合成增强所致。与未感染的对照组相比，转录组分析检测到感染猪的近端结肠组织中HDC mRNA水平增加了2.05倍（p <0.0001）（图6b）。更重要的是，喂食KO后，HDC（一种编码组氨酸代谢限速酶的基因）的表达量小幅度但显著降低（图6b，p=0.0085）。
偏最小二乘判别分析（PLS-DA）将trigonelline，组胺和N-乙酰基组胺确定为在感染下将KO与SO区分开来的前3种代谢物（图6c）。RF表明，在研究中，不管感染状况如何，肠道组胺水平与微生物分类单元均具有很小的关联性（p = 0.0150）。通过RF鉴定出的最高的组胺水平微生物预测指标包括乳酸杆菌，大肠埃希氏菌，韦永氏菌和梭状芽胞杆菌（图6d）。
图6 磷虾油抑制猪组氨酸代谢
（a）组氨酸代谢途径图。（b）近端结肠组织中编码L-组氨酸脱羧酶（HDC）的标准化基因转录丰度被磷虾油显著降低。SC：饲喂大豆油（SO）的未感染猪，SI：饲喂SO的感染猪，KC：饲喂KO的未感染猪，KI：饲喂KO的感染猪。（c）应用偏最小二乘判别分析（PLS-DA）方法，根据变量重要度投影（VIP）评分，对感染猪的重要代谢产物进行排序。（d）随机森林回归模型筛选出与结肠管腔组织胺水平相关的重要属。%IncMSE=均方误差增加
网络模块特征关系使用Pearson相关分析进行了研究。在用SO喂养的感染猪中，模块＃2与组胺和1-甲基组胺值均呈负相关（p <0.05），而模块＃4与组胺和1-甲基组胺值均呈负相关（r =–0.86，p = 0.001；图7a）。这两个模块的显着属性是，大多数节点（OTU）都属于梭菌纲。从补充KO的感染猪推断出的网络中，模块＃13与1-甲基组胺呈负相关（r =–0.72，p =0.0200）。该模块的9个节点中的8个属于梭菌。总之，这些发现表明梭状芽孢杆菌目物种之间的强烈微生物相互作用可能会降低肠道1-甲基组胺值。更有趣的是，感染和KO补充网络中的模块＃14（图7b）与组胺（r = 0.77，p = 0.0090）和1-甲基组胺（r = 0.82，p =0.0040）都有很强的正相关性。值得注意的是，模块＃14中的所有OTU都属于乳杆菌属。尽管仍需要进一步的实验验证，这些发现表明，在乳酸杆菌和梭状芽胞杆菌中，使用益生元和益生菌促进微生物之间的强烈相互作用，可能对组氨酸代谢具有重要的调节作用。
图7 与猪模型中肠腔内组胺和1-甲基组胺浓度相关的网络模块
SI：饲喂SO的感染猪；KI：饲喂KO的感染猪。实线：正相关；虚线：负相关。每个节点（OTU）的颜色表示此OTU分配到的门。r：相关系数；P：显着性（概率）
5．使用Th1依赖型结肠炎小鼠验证磷虾油促解决特性及其对肠道微生物的调节作用
为了验证乳酸菌相关物种在调节KO抗炎反应中的重要性和参与性，试验利用C. rodentium诱导C3H/HeNCr小鼠结肠炎模型。与T. suis诱导Th2的不同，C. rodentium诱导了独特的Th1/Th17免疫应答。C. rodentium感染的小鼠出现显著体重下降和脾脏指数增加（图8a, b,p < 0.05).）。结肠长度和结肠指数（定义为5.0厘米长的结肠柱中的结肠重量除以总体重）也受到感染的显著影响。与感染组的小鼠相比，饲喂KO可以部分地减轻体重减轻并改善脾脏指数（p <0.05）。KO使粘膜附着的C. rodentium的细菌载量（每克结肠组织样品）显着减少，从感染组（CM）的7.59±0.57（对数菌落形成单位或cfu/ g）降至6.85±0.82（log cfu/g）（图8c，p <0.05）。饲喂KO的小鼠，由C. rodentium诱导的炎性浸润的数量减少（图8d）。此外，KO补充导致由C. rodentium感染升高的促炎细胞因子（如TNF，IL1β，IL12，IL17A，IL22和CCL2）的表达水平显著降低（图8e）。
非靶向代谢组分析确定，与健康小鼠相比，结肠炎小鼠中至少有10种代谢物的水平显着降低（表1，FDR <0.05）。这些代谢物参与了四个促解析途径，如阿司匹林引起的resolvin E生物合成，阿司匹林引起的脂蛋白生物合成，白三烯生物合成和脂蛋白生物合成。例如，在结肠炎小鼠中，resolvin E1的肠腔内浓度比健康对照组低3.3倍，而脂蛋白A4和B4的水平低2.7倍。KO补充显着增加了至少三种参与促分解途径的代谢物，包括阿司匹林引起的resolvin E和脂蛋白生物合成途径。这些发现为KO改善炎症的初始阶段和缓解阶段提供了进一步的支持。
表1 添加磷虾油（KO）可增加促分解途径中的代谢物，尤其是E-系列分解素的生物合成
倍数变化的计算是基于Citrobacterrodentium诱导的结肠炎小鼠（CM）的归一化峰强度除以健康对照小鼠（Down失调）或KO除以CM（Up失调）的峰强度。途径：A：阿司匹林引起的RESOLVIN E生物合成；B，阿司匹林引起的脂蛋白生物合成；C，脂蛋白的生物合成；D，白三烯生物合成。
C. rodentium感染对肠道微生物组成有着显著影响。与健康对照组相比，结肠炎小鼠共有18个属的数量发生了变化。例如，与健康对照组相比，结肠炎模型中的Sutterella丰度显著增加了约860倍。微生物营养不良指数（MDI）定义为粪球菌属（Coprococcus）和拟杆菌属（Bacteroides）的总和与SMB53的总和的对数比。如图8f所示，与健康对照组相比，结肠炎小鼠的MDI明显更高（Wilcoxon p = 2.20×10-5）。饲喂KO可使MDI显着改善，从结肠炎小鼠的0.74到饲喂KO的小鼠的0.23（p = 4.10×10-5）。KO还影响了18个被感染显着改变的属中的三个，SMB53，欧文氏菌（Erwinia）和双歧杆菌（Bifidobacterium）。KO将感染引起的SMB53丰度的显著增加（~2800倍）逆转至基线水平。这三个属都是最重要的特征，有助于通过RF对PBS组中的KO进行分类（图8g）。RF和sPLA-DA算法都按此顺序将SMB53，欧文氏菌（Erwinia）和双歧杆菌（Bifidobacterium）列为KO和PBS组之间的三个重要特征。KO对与乳杆菌有关的几个OTU的丰度也有重要影响。分配给乳杆菌的OTU的丰度从感染引起的> 2000倍增加而反转为基线。至少三种细菌种类，产气荚膜杆菌（Clostridiumperfringen），罗伊氏乳杆菌（L. reuteri）和阴道乳杆菌（L. vaginalis）具有相似的趋势（图8h）。乳杆菌（Lactobacillus）和未分类的Lactobacillales目下的乳杆菌属是通过RF进行KO分类的重要特征之一（图8g）。
图8 补充磷虾油减轻了Citrobacter rodentium诱导的小鼠结肠炎
磷虾油（KO）改善了体重减轻（a）和脾脏指数（b），减少了C.rodentium在结肠粘膜中的负荷（c）并改善了组织学评分（d）。KO补充显着降低了促炎细胞因子和趋化因子（包括IL1β，TNF，IL12B，IL17A，IL22和CCL2）的表达（e）。f KO补充显着改善了微生物营养不良指数（MDI）。*** Wilcoxon秩和p <0.001。（g）用随机森林模型筛选出20个重要属进行补充状态分类（KO或PBS）。（h）通过补充KO可以将三种细菌种类的相对丰度降低至基线水平：罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri），阴道乳杆菌（L.vaginalis）和产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens）。***p < 0.001; **p < 0.01; *p < 0.05
6、对小鼠结肠炎相关病理生理特征具有较高预测准确性的微生物特征
C. rodentium感染和补充KO对结肠的一些病理生理参数有显著影响，如结肠长度、结肠指数、脾脏指数和每克结肠组织C. rodentium数量。由分子SMB53和分母拟杆菌（Bacteroides）组成的全局平衡可以准确预测PBS对照组的KO补充量（CV-AUC = 1.0，图9v）。平衡值为负，表明SMB53的相对丰度比拟杆菌更低。较低的平衡值表明KO补充与SMB53丰度的显着降低和拟杆菌的丰度同时增加有关。由Bacteroides和Trabulsiella组成的微生物特征对感染和未感染小鼠的微生物群落进行了高精度分类（CV-AUC=0.92，图9b）。由分子Odoribacter和分母RF32中的未分类属组成的微生物特征对结肠长度具有很强的预测能力（R2=0.864），而由Trabulsiella、Lactococcus和Eubaterium组成的微生物特征对结肠指数具有很强的预测准确度（R2=0.888，图9c）。此外，分子Trabulsiella和分母Coprococcus的微生物特征强烈地预测了结肠中C. rodentium的数量（R2=0.687；图9d）。在本研究中，有两个OTU被指定为Citrobacter，而7个OTU被分配到Trabulsiella（其中4个注释为T. farmeri）。欧洲核苷酸档案馆指出，Trabulsiella的Greengenes分配可能不正确。所涉及的OTU的代表性序列也已映射到核糖体数据库项目数据库中的Citrobacter，但具有90％的相似性水平。总之，这些数据表明，在小鼠模型中鉴定出的Trabulsiella属可能是由于Citrobacter引起的。
图9 与小鼠结肠炎的病理生理表型有关的微生物特征或平衡
箱形图表示每个类别中的平衡值分布。平衡表中的微生物类群列在图表顶部。a由SMB53和Bacteroides组成的平衡可区分KO和PBS对照。b显示区分感染状态的平衡。图表的右侧代表每个类别的密度曲线。CV-AUC =交叉验证调整后的ROC曲线下的平均面积（AUC）。平衡显示与结肠指数（c）和结肠组织中Citrobacter rodentium菌量（计数）（d）密切相关。y轴分别表示结肠指数（c）和log10 Citrobacter计数（d）的数值。x轴是平衡值。较低的平衡值与较低的结肠指数、减少的细菌负荷或改善的结肠炎表型有关。
讨论
富含多不饱和脂肪酸（PUFA）的膳食补充剂，如鱼油，已被广泛用于治疗各种疾病，包括结肠炎。KO富含ω-3多不饱和脂肪酸（高达31.5%），特别是容易吸收的磷脂形式。此外，KO还含有抗氧化剂虾青素。本研究证明KO通过调节NF-κB和NOD信号通路等多种信号通路发挥抗炎活性，并在体外抑制促炎细胞因子。
KO似乎参与炎症的分解阶段，已证明其具有体外促进M2极化和增强巨噬细胞胞内杀伤的能力。在小鼠结肠炎模型中，KO显着增加了几种与促分解途径有关的代谢产物（例如resolvin E2）的肠腔内水平，尤其是阿司匹林触发的resolvin E和脂氧素的生物合成。与健康对照组相比，结肠炎模型中这些途径的多种代谢产物失调。已知Resolvins可以协调炎症的解决。除直接的抗炎作用外，脂氧素和resolvin还通过增强巨噬细胞介导的凋亡性中性粒细胞清除而促进炎症消退。KO在抑制THP1细胞中LPS诱导的促炎性介质方面，与COX2和IKK2抑制剂具有协同作用。在猪模型中观察到其具有减轻寄生蠕虫诱导的肠组织损伤并促进粘膜愈合的潜力。
该研究证明了KO对猪和鼠模型中的肠道微生物组都有很强的调节作用。KO显着改善了肠道微生物营养不良指数并增加了微生物丰富度，这与之前报道n-3 PUFA可以增加中老年妇女的微生物多样性结论一致。
组胺是一种重要的免疫调节剂，可通过与其受体相互作用而发挥多效作用。这项研究证明组氨酸代谢途径中的多个关键代谢物（例如组胺和1-甲基组胺）通过KO补充显着降低了结肠腔内容物感染引起的水平升高。使用PLS-DA模型，在感染条件下，组胺被区分为将KO与SO组区分开来的前三个变量之一（图6c）。在补充KO的动物中，顺式尿糖酸水平也随之升高。数据表明，KO可能通过使组氨酸经HAL转化为尿酸盐的平衡而影响组氨酸的代谢。研究发现HDC（一种编码催化组氨酸转化为组胺的限速酶）的mRNA表达在猪结肠黏膜中显著降低，进一步支持了这一观点。补充KO破坏了一个与SO亚网络中观察到的肠道组胺水平有显著相关性的模块（MEyellow），这也可能是喂养这些动物的组胺水平降低的原因之一。RF回归模型确定了乳酸杆菌、大肠杆菌、韦荣氏球菌属和梭状芽孢杆菌是与肠腔组织胺水平相关的最重要特征（图6d）。某些罗伊氏乳杆菌菌株含有编码HDC的基因簇，并将饮食中的组氨酸转化为组胺，从而激活H2R并调节急性炎症。来自罗伊氏乳杆菌的组胺增加cAMP，从而抑制经由蛋白激酶A的下游MEK/ERK MAPK信号传导并抑制TNF的产生。试验数据表明，KO显着降低了罗伊氏乳杆菌和其他几种乳酸杆菌的丰度（图8h）。KO可能通过抑制乳酸杆菌的丰度来调节微生物来源的组胺。KO、组胺及其受体与肠道微生物之间的密切相互作用有待进一步研究。对这些新的相互作用机制的理解可能为治疗学的发展提供新的希望。
IL17作为一种温和的炎症效应因子，与其他炎症介质如TNFα和IFNγ协同作用于自身免疫性疾病和癌症的致病和保护过程。研究发现，KO显著降低人巨噬细胞样THP1细胞中IL17RA的表达（FDR调节p=6.21×10-6），同时抑制小鼠结肠黏膜中IL17A的表达。ω-3 PUFA前体α-亚麻酸及其衍生物（EPA和DHA）通过降低人类单核细胞和脂肪干细胞中细胞间粘附分子1的表达来抑制IL17A的分泌，为ω-3 PUFA在抑制IL17相关炎症方面的作用提供了证据。在猪T.suis感染模型中，喂食KO可使分节丝状菌（SFB）的结肠管腔发病率增加4.5倍。因此，在区分KO和SO时，SFB是RF识别的重要特征之一（图5c）。SFB是Th17细胞分化和诱导IgA产生的关键因子。另一方面，Th17细胞控制SFB负荷。在IL17RA基因敲除小鼠中观察到大量的SFB过度生长；而且，野生型小鼠的抗IL17RA治疗增加了SFB的定植。猪的SFB主要附着在回肠上皮上。研究中，从近端结肠取样肠腔内容物。目前尚不清楚管腔内容物中SFB丰度的增加是否与KO对SFB附着的影响有关。
微生物特征是一组可以更好地预测治疗结果或感兴趣表型的分类群，具有实用价值。类群间相对丰度的平衡或对数比值可以克服样本大小差异的问题，并可作为生物标志物开发。这项研究中鉴定了多种微生物特征，这些特征对于饮食治疗效果有很高的鉴别能力或预测准确性，或者与结肠炎相关的病理生理表型有密切联系。在猪模型中，由Proteobacteria中两个未分类属，Rickettsiales中一个属和DeltaProteobacteria中的另一个组成的平衡，对补充KO有相对较高鉴别能力。补充KO后Rickettsiales相对丰度减少（图5a）。较低（负）的平衡值可区分KO。KO对这些人畜共患病原体的抑制作用可能会增加一些额外的健康益处。饲喂KO会显着增加肠道腔内含量和血清中的EPA和DHA。由CF231属（分子）和两个属vadin CA11和Dehalobacterium（分母）组成的微生物特征与肠腔EPA含量密切相关。已知Dehalobacterium与体重指数呈负相关。
研究确定了与结肠炎相关表型的几种预测平衡。由Odoribacter和RF32中未分类属组成的平衡具有较高的结肠长度预测准确性（R2 =0.864）。Trabulsiella、沙门氏菌，以及S24-7和Trabulsiella，乳球菌和大肠埃希菌中未分类的属，分别对结肠重量（R2= 0.922）和结肠指数（R2 = 0.888）有很强预测作用。虽然单个分类群的相对丰度可能不太相关，但由一组分类单元组成的平衡可以更好地区分与结肠炎相关的表型，因此可以作为结肠炎严重程度的有价值的生物标志物。
结论
目前对结肠炎相关疾病的治疗主要集中在炎症的初始阶段。使用基于饮食的疾病干预方法，可能会为IBD的治疗提供更好的选择。长期摄入KO的全部益处可能来自多种代谢和信号通路的协同作用。试验探究了补充磷虾油（KO）对炎症初期和缓解前阶段的影响。KO可抑制Th1和Th17相关细胞因子的表达，促进巨噬细胞的杀菌活性。KO通过增加物种丰富度和调节微生物相互作用，部分恢复了感染性结肠炎模型中的微生物失调。此外，KO对宿主和微生物来源的组氨酸代谢中关键代谢产物的抑制作用有助于其抗炎活性。研究还确定了与结肠炎表型相关的几种微生物预测平衡。并为寻找反映结肠炎严重程度的有价值的生物标志物提供了方法。