编译：Y.too，编辑：Tracy、江舜尧。
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导读
红景天苷是一种广泛存在于红景天和女贞属植物中的苯乙醇苷。我们以前的研究报道红景天苷可以通过改善载脂蛋白E缺乏（apoE-/-）小鼠的糖脂和甘油磷脂代谢来阻止动脉粥样硬化的进展，然而，其对中性脂质的影响及其机制尚不清楚。本文结合代谢组学和转录组学模式，从代谢调控的角度探讨红景天苷作用的分子机制，结果表明，红景天苷通过下调胆固醇调节元件结合蛋白（Srebf1和Srebf2）的基因表达，显著降低肝脏胆固醇、酯化胆固醇、脂肪酸、不饱和脂肪酸和三酰甘油的生物合成。SREBPs靶向和下游基因的表达，如脂肪酸合成酶（Fasn）、甘油-3-磷酸酰基转移酶（Gpam）、硬脂酰辅酶A去饱和酶（Scd）、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶（Hmgcr）和前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin9型（Pcsk9）的编码基因，红景天苷也能抑制细胞凋亡。ATP柠檬酸裂解酶基因（Acly）编码一种重要的乙酰辅酶a生成酶，用于胆固醇和脂肪酸的生物合成；此外，酮体产物3-羟基丁酸在药物治疗组显著上调，表明红景天苷同时加速脂肪酸降解。我们的研究发现红景天苷是动脉粥样硬化小鼠体内脂质稳态的调节因子，暗示其有可能成为降低动脉粥样硬化相关疾病风险的替代药物。
原名：Salidroside simultaneously reduces de novo lipogenesis and cholesterol biosynthesis to attenuate atherosclerosis in mice译名：红景天苷同时减少新生脂肪生成和胆固醇生物合成以减轻小鼠动脉粥样硬化期刊：Biomedicine Pharmacotherapy
1. 采用组织病理学及血清生化指标分析红景天苷对动脉粥样硬化小鼠主动脉弓和肝脏损伤的影响；
2. 利用核磁代谢组学分析红景天苷对动脉粥样硬化小鼠肝脏代谢组的改变，并采用有监督的PLS-DA模型进行分析；
3. 利用转录组学分析红景天苷对动脉粥样硬化小鼠肝脏中基因表达的影响，并采用通路富集分析相关基因的生物学功能。
我们给与载脂蛋白E缺乏（apoE-/-）小鼠红景天苷12周,然后H&E染色组织切片的组织学分析（图1A）显示对照组主动脉内膜光滑完整。模型组主动脉内膜富脂泡沫细胞聚集形成明显的纤维斑块，辛伐他汀和红景天苷治疗组动脉粥样硬化病变减少；模型小鼠肝内肝索结构不清，肝细胞空泡变性、肿胀、水变性明显，辛伐他汀和红景天苷治疗后，肝索结构清晰，肝细胞空泡变小。血清生化分析结果（图1B）显示模型组TC、TG和LDL-C水平显著升高，辛伐他汀和红景天苷治疗组TC、TG和LDL-C水平显著降低（p<0.05）；然而，辛伐他汀和红景天苷对apoE-/-小鼠的体重和食物摄入量的影响较弱（图S1），对照组小鼠进食量明显高于其他各组apoE-/-小鼠。根据食物热量表，高脂饮食（4047 kcal/kg）的热量远高于正常饮食（3240 kcal/kg），尽管对照组小鼠摄入了更多的正常饮食，但各组小鼠的卡路里摄入量是相似的。由于两种剂量的红景天苷均能减轻动脉粥样硬化小鼠主动脉弓和肝脏的损伤，故我们对RH25组进行进一步的代谢组学和转录组学分析。
（A）主动脉弓和肝组织苏木精-伊红染色。（B）血清总胆固醇（TC）、总三酰甘油酯（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）和高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）水平。我们根据文献和公共数据库对1H-NMR谱的信号进行了解释，并用二维NMR数据进一步证实。我们从肝组织中鉴定出53种代谢物，包括氨基酸、有机酸、生物碱、糖和核苷酸（表S2）。为了研究两组间代谢谱的差异，binning 1H-NMR数据采用有监督的PLS-DA模型，交叉验证得分图显示对照组和模型组之间以及RH25和模型组之间的明显聚类和区分（图2A）。在两个阈值（VIP>1和p<0.05）下，我们将22种不同的代谢物鉴定为不同的模型组和对照组，包括缬氨酸、3-羟基丁酸、乳酸、丙二酸甲酯、丙氨酸、乙酸、谷氨酸、琥珀酸、谷氨酰胺、谷胱甘肽、丁二腈、肌酸、胆碱、三甲胺N-氧化物（TMAO）、葡萄糖、甘露糖、糖原、延胡索酸、鹅绒碱、黄嘌呤、次黄嘌呤和烟酰胺，其中，红景天苷显著上调肝脏中3-羟基丁酸、黄嘌呤和胆碱的水平，下调糖原、甘露糖、葡萄糖、丁二腈、丙氨酸、谷胱甘肽、琥珀酸、烟酰胺和谷氨酰胺的水平，使其恢复正常水平。
（A）对照组和模型组之间的PLS-DA评分图（n=10）。（B）模型组和RH25组之间的PLS-DA评分图（n=10）。（C）显示肝组织中所选差异代谢物的热图。氯仿萃取的典型1H-NMR光谱如图3A所示，δ 0.68 ppm处的单峰被分配给胆固醇中的C-18甲基氢。胆固醇和酯化胆固醇中C-10上的C-19甲基氢分别出现在δ 1.00和1.02 ppm处；在δ 4.62 ppm处的多峰归属于酯化胆固醇中C-3-甲基苯基的氢；在δ 0.80～0.89 ppm范围内的信号来自脂肪酸末端CH3的氢；在δ 5.30～5.40 ppm范围内的信号来自不饱和脂肪酸中的乙烯基；甘油三酯主链在δ 4.14、4.29和5.26 ppm处分别出现三个多峰（表S3）。相对含量的比较表明，高脂饮食诱导apoE-/-小鼠胆固醇、酯化胆固醇、脂肪酸（FAs）、不饱和脂肪酸和三酰甘油水平升高，红景天苷给药后，这些脂质的水平都显著降低（图3B）。
（A）肝脏样品中非极性脂质的质子信号分配。（B）中性脂质的热图显著改变。RNA-Seq分析结果显示，2091个基因在模型组和对照组之间的表达存在统计学差异，446个基因在RH25和模型组之间的表达存在差异，两个阈值的倍数变化>2，q值<0.05（图4A）。Venn图显示，红景天苷治疗后，模型组72个下调基因表达上调；另一方面，模型组上调的182个基因被红景天苷下调（图4B），结果表明，共有254个与动脉粥样硬化相关的基因被红景天苷调控到正常水平。为了解红景天苷调节相关基因的生物学功能，我们对上述254个差异表达基因进行了途径富集分析。基于京都基因与基因组百科全书（KEGG）路径数据库，这些基因富集到19条路径中，p值小于0.05，其中6个错误发现率（FDR）值小于0.05，包括萜类主链生物合成、类固醇生物合成、PPAR信号通路、丙酮酸代谢、脂肪酸生物合成和谷胱甘肽代谢（图5A）。根据反应途径知识库，有32条途径的p值和FDR值均小于0.05，其中与代谢过程密切相关的前12条途径是SREBP激活基因表达、SREBP调节胆固醇生物合成、胆固醇生物合成、脂质和脂蛋白代谢、脂肪酸、三酰甘油和酮体代谢、PPARA激活基因表达、生物氧化、通过过氧化物酶体增殖物激活受体α（PPARα）、脂肪酰辅酶A生物合成、甘油三酯生物合成、ChREBP激活代谢基因表达和按底物类型排列的细胞色素P450-调节脂质代谢（图5B），参与这些途径的基因详见表1。红景天苷通过下调Fasn、Acaca、Acacb、Hmgcs1、Hmgcr、Mvk及其下游基因，抑制了脂肪酸的从头合成和胆固醇的生物合成，红景天苷也抑制了甘油三酯合成的关键基因Gpam和Acly的表达。SREBP和ChREBP是介导脂质代谢的两种转录因子，但编码ChREBP的基因无明显变化。INSIG通过控制SREBPs的激活，在维持细胞内脂质代谢稳态方面发挥着重要作用。与模型组相比，红景天苷可下调apoE-/-小鼠的Insig1、Srebf1和Srebf2的表达水平，表明红景天苷可能通过INSIG1-SREBP途径抑制新生脂肪生成和胆固醇合成。细胞成分的功能富集也表明SREBP-SCAP-INSIG复合物与PCSK9-LDLR复合物一起受到红景天苷的影响（图5C），表2总结了参与新生脂肪生成和胆固醇生物合成途径的差异基因。转录组测序结果通过对26个选定基因的实时定量PCR（RT-qPCR）实验进一步验证，RT-qPCR的结果与RNA-seq的结果一致（图5D）。
（A）差异表达基因（DEGs）的火山图，变化倍数>2，q值<0.05。（B）模型与对照组和RH25与模型组（n=3）两种情况下常见DEG的维恩图。
（A）254个DEGs富集到p值小于0.05的前19条途径中，其中6条FDR值小于0.05，包括萜类主链生物合成、甾体生物合成、PPAR信号途径、丙酮酸代谢、脂肪酸生物合成、谷胱甘肽代谢、细胞周期和丙酸代谢。（B）根据反应途径知识库，前12条丰富了DEGs的反应途径，p值<0.05。（C）基于字符串数据库的DEGs功能丰富。（D）RNA-Seq中25个DEGs的定量实时PCR验证。表1 参与前12条富集反应组途径和前6条富集KEGG途径的基因
表2 参与新生脂肪生成和胆固醇生物合成途径的差异表达基因
血脂异常是导致动脉粥样硬化的重要危险因素之一。根据2019年ACC/AHA心血管疾病一级预防指南，降脂药物是目前降低动脉粥样硬化性心血管疾病（ASCVD）风险的治疗方法之一。他汀类药物作为3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a（HMG-CoA）还原酶的抑制剂，仍然是低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）升高患者ASCVD一级预防的一线治疗药物；然而，他汀类药物存在一些局限性，如他汀相关肌肉症状（SAMS）、易感个体发生糖尿病的风险、转氨酶无症状升高和成本效益等，因此，开发更多的降脂分子是使更多受试者胆固醇水平达到预期结果的重要措施。先前的研究表明，红景天苷可以显著降低动脉粥样硬化小鼠血清中的LDL-C水平，但其机制尚未完全清楚。红景天苷是红景天和女贞属植物的天然产物，据报道，红景天苷口服给药后，血浆中的浓度高于组织中的浓度，半衰期较短，约1h。红景天苷在脑组织中含量最低，肝脏、脂肪和骨骼肌中含量较高。在本研究中，我们通过整合转录组和代谢组分析研究红景天苷在动脉粥样硬化小鼠中的降脂作用。我们发现红景天苷在代谢和转录水平上改善脂质代谢紊乱，其途径包括胆固醇生物合成、脂肪酸和脂肪酰基辅酶A生物合成以及甘油三酯生物合成（图6）。固醇调节元件结合蛋白（SREBPs）是脂质稳态所需的一个转录激活因子家族。SREBP1（Srebf1）调节LDL受体基因以及脂肪酸的转录，在较小程度上调节胆固醇合成途径，而SREBP2（Srebf2）最强烈地激活胆固醇生物合成。与模型组相比，红景天苷能显著降低apoE-/-高脂饲料小鼠Srebf1和Srebf2的表达。
图6 红景天苷对动脉粥样硬化小鼠血脂异常的调节作用综述Srebf1的编码基因包括脂肪酸合成酶（FAS；Fasn）、甘油-3-磷酸酰基转移酶（GPAT；Gpam）、乙酰辅酶a羧化酶1（ACC1；Acaca）和硬脂酰辅酶（SCD1；Scd1）的编码基因。FAS是脂肪酸生物合成过程中的关键合成酶，ACC1催化长链脂肪酸生物合成中的限速反应，SCD1在调节参与不饱和脂肪酸生物合成的基因表达和调节线粒体脂肪酸氧化中发挥重要作用，甘油三酯的合成是由GPAT催化的甘油-3-磷酸酰化开始的。红景天苷抑制Srebf1的表达，导致Fasn、Acaca、Scd1和Gpam的减少。红景天苷可改善致动脉粥样硬化小鼠的代谢表型，包括降低肝脏中脂肪酸、不饱和脂肪酸和三酰基甘油的水平；此外，3-羟基丁酸作为脂肪酸氧化的酮体产物之一，在药物处理组中显著上调，说明红景天苷不仅抑制了脂肪生成，而且加速了脂肪酸降解；另一方面，SREBP2（Srebf2）选择性地调节编码胆固醇生物合成酶的基因的转录，包括HMG-CoA还原酶（HMGCR；Hmgcr）、HMG-CoA合酶1（HMGCS1；Hmgcs1）、甲羟戊酸激酶（MVK；MVK）和前蛋白转化酶枯草杆菌素/可辛9型（PCSK9；Pcsk9）。由于Srebf2的减少，Hmgcs1、Hmgcr、Mvk及其下游基因Pmvk、Mvd、Fdft1、Sqle、Lss、Cyp51、Nsdhl、Sc5d和Dhcr7的转录均被红景天苷显著下调。这些基因编码从乙酰辅酶a开始参与胆固醇生物合成的酶，尽管乙酰辅酶a合成酶（AACS；Aacs）不是Srebf2的靶点，Aacs也被下调。红景天苷通过降低Srebf2的表达水平，从而达到降低肝脏和血清胆固醇水平的目的。PCSK9是促进肝脏中LDLR降解，然后控制血浆中LDL胆固醇水平的枯草杆菌蛋白酶的成员。作为SREBP2靶基因之一的Pcsk9在药物治疗后下调，这表明红景天苷可能调节PCSK9-LDLR复合物以维持体内胆固醇稳态。值得注意的是，红景天苷可同时降低ATP柠檬酸裂解酶（ACLY；Acly）的基因表达。ACLY是HMGCR和FAS，甚至AACS上游胆固醇和脂肪酸生物合成途径中的重要酶。ACLY通过从柠檬酸盐产生乙酰辅酶A用于胆固醇和脂肪酸生物合成，将碳水化合物与脂质代谢联系起来。通过动物实验和人体临床试验，ACLY抑制剂已被证实能改善血脂异常和抑制动脉粥样硬化病变。我们发现红景天苷不仅降低了Srebf1和Srebf2水平，而且还降低了Acly表达，以减轻致动脉粥样硬化小鼠的血脂异常。高脂饲料喂养的apoE-/-小鼠出现高脂血症并伴有血糖升高，而三酰甘油的升高通常与胰岛素水平的升高同时发生。据报道，SREBF2可影响胰岛素抵抗和胰腺B细胞功能，导致血糖升高。代谢组学数据显示，红景天苷除了对脂质代谢有作用外，还可显著降低致动脉粥样硬化小鼠肝脏的葡萄糖和糖原水平，这可能与红景天苷上调Trib3和下调Srebf2的协同作用有关。Trib3是一个编码tribbles同源物3蛋白的基因，它可以通过直接与Akt激酶结合并阻断其激活来破坏胰岛素信号。此外，红景天苷还改善了谷氨酸代谢、葡萄糖-丙氨酸循环和谷胱甘肽代谢，表明红景天苷具有抗氧化能力和促进神经递质合成的作用；然而，只有少数参与这些通路的基因发生了明显的改变，其他基因的FC值均小于2。
综上所述，本研究证明红景天苷通过降低apoE-/-小鼠血清和肝脏中脂肪酸、胆固醇和三酰甘油的水平来抑制动脉粥样硬化的进展。肝脏基因表达分析进一步显示红景天苷显著降低胆固醇、脂肪酸和三酰甘油生物合成途径相关基因的表达，增加脂肪酸降解和胆固醇代谢相关基因的表达。红景天苷的作用靶点可能是INSIG-SCAP-SREBP复合物和PCSK9-LDLR复合物，这有待进一步研究证实和支持。综上所述，我们的研究结果提供了红景天苷抗动脉粥样硬化的潜在治疗应用，其机制不同于他汀类药物。
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33341055/
