综述 | Curr Opin Chem Biol：碳水化合物代谢新途径的发现
编译：胜寒，编辑：Tracy、江舜尧。
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缩小日益增长的全基因组序列的可用性和酶代谢新途径的发现之间的差距是一个重要的挑战。作者在这篇文章中回顾了最近的研究结果，包括体外酶活性的分配和体内未表征蛋白的代谢功能，重点介绍了单糖和多糖的分解代谢和生物合成过程中涉及的酶和代谢途径。最有效的方法是基于蛋白质家族的序列-功能空间分析，为预测未表征酶的功能提供线索。总的来说，这种方法可以发现新分子的分解代谢、普通分子的代谢新途径和新的酶化学。
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内容
1.前言
基因组注释提供生物体代谢潜能的描述。然而，基因组测序和功能分配之间存在时滞，导致基因组数据中的“催化暗物质”。作者和其他研究人员开发了蛋白质功能表征的策略，利用蛋白质家族的序列相似性网络(SSNs)和宏基因组丰度(使用化学引导功能谱)来确定目标的优先级，以发现新的代谢途径。SSNs为利用基因组邻近网络(GNNs)分析基因组背景提供了一个切入点，其中细菌、古生菌和真菌蛋白的基因组邻近网络有助于识别代谢途径中功能相连的基因。糖分解代谢的研究主要集中在多糖利用位点的碳水化合物活性酶和将单糖转化为有用代谢碳源的分解途径上。本文综述了近年来在细菌和真菌中发现的多糖、药物葡萄糖苷缀合物和罕见单糖的代谢途径，以及其中发现的新的酶化学。
2. 从复杂分子中产生不稳定的单糖
2.1 石莼聚糖
石莼聚糖是形成石莼细胞壁的复杂多糖。石莼和浒苔的繁殖主要是为了食用，石莼占藻类干重的30%以上。在发现裂解酶之前，参与分解代谢的酶是未知的，研究者通过对细菌基因组的分析确定了多糖利用位点，其中包括这些裂解酶和其他糖利用酶，如糖苷水解酶，分析鉴定出Formosa agariphila KMM 3901的12种酶，它们可以将这个复杂的硫酸酸化多糖转化为可代谢的单糖(图1a)。简而言之，两种胞外裂解酶释放较短的多糖，在非还原端形成不饱和的醛酸盐。在输入这些低聚糖和水解分支D-葡糖苷酸后，葡萄糖水解酶和硫酸酯酶协同作用释放硫酸盐以及4-deoxy-L-threo-hex-5-ulosuronate。
2.2 葡萄糖醛酸酶药物
肝脏中的酶可以羟基化，在许多修饰中，葡萄糖醛酸化药物，而肠道微生物通常会逆转这些变化，进行水解和还原反应，导致这些分子药理特性的改变。细菌β-葡萄糖醛酸苷酶(GUSs)可以从修饰过的药物中去除葡萄糖醛酸苷，通过结构和活性位点环来突出这些酶的多样性。这些不同的GUSs在与医学相关的底物上进行测试，水解修饰过的双氯芬酸葡萄糖醛酸酯(图1c)。非甾体抗炎药可引起小鼠小肠溃疡，并通过抑制小鼠肠道细菌溃疡病促进非甾体抗炎药排泄，减少小鼠溃疡数量。研究者对这一家族GUSs的SSN分析发现，每个SSN簇中的酶都有相似的活性位点环，不同的SSN集群可以共享循环类型，但是不同簇合物中的GUSs对抑制剂的催化效率和敏感性并不相同(图1d)。这项工作强调了酶可以共享域结构和活性位点环，但像SSN这样的工具可以帮助功能预测，而不仅仅是简单的BLAST比较。
图1 多糖和药物葡萄糖醛酸代谢途径的发现
（a）复杂的硫酸化多糖ulvan分解为简单的单糖的简要例子。带“ S”的数字表示糖上硫酸根的位置。（b）细菌GUS可以从修饰药物中去除D-葡萄糖醛酸，如DCF-G所示。（c）从Ref重新创建的SSN，突出显示“环1”型酶的出现（具有这种环型的节点显示为三角形），并根据DCF-G的活性程度进行着色。测试活性的酶显示为大节点。DCF-G，双氯芬酸葡糖醛酸；GUSs，细菌性b-葡萄糖醛酸糖苷酶；SSN，序列相似性网络。
3. 将糖分解为中枢代谢物
3.1 通过基因组挖掘和筛选溶质结合蛋白的发现
研究者发现分解途径的一个有吸引力的方法是筛选ABC、TRAP和TCT转运系统的溶质结合蛋白(SBPs)作为它们的配体，编码SBP的基因，转运系统的膜成分，以及配体的分解代谢途径通常是固定的。这种策略是有利的，因为SBP的配体是通路中第一个酶的底物，研究者利用差示扫描荧光法观察到D-苏糖醇和木糖醇稳定SBP，集中表征基因组近端酶作为D-苏糖醇分解途径的初始步骤。一系列的SSN和GNN分析发现，三种四醇分解途径具有相同的酶促步骤，并注释了三种途径的基因(图2a)。
将这种策略与计算预测相结合，可以帮助解决越来越多的未知功能的蛋白质。综合途径映射用于途径酶结构活性位点潜在底物/产物的硅对接(通过同源建模获得)，提供底物特性和反应类型的预测，整合通路定位成功预测了流感嗜血杆菌Rd KW20中L-古洛糖酸的分解通路。为了完成这一整合通路的定位，研究者筛选了SBPs的潜在配体，通过GNN分析确定了预测的途径酶(一个醛缩酶，一个脱水酶，两个脱氢酶和一个激酶)；用对接的配体模拟酶的结构，并对潜在底物进行排序。假设的途径受到每种酶所能催化的反应类型和碳分解代谢所产生的代谢物限制，有研究预测并验证了L-古洛糖酸的转化为甘油醛- 3-磷酸和丙酮酸。
图2 发现新的糖分解途径
（a）耻垢分枝杆菌mc2155中的四醇分解代谢利用共有相同酶促步骤的三个途径。（b）大肠杆菌K-12的ydj簇中的八磺酸盐分解代谢的特征。（c）回收SAM副产物5-脱氧-D-核糖和S-甲基-5-硫代-D-核糖使用相同的酶促逻辑，在某些情况下使用相同的酶。（d）具有广泛特异性的糖酸脱水酶允许huttiense IAM 15032通过非磷酸化分解代谢途径分解代谢具有相同C2和C3立体化学的一组糖。
3.2 大肠杆菌中“y基因”簇的注释
尽管大肠杆菌K-12 MG1655被用作模式生物，但它并没有一个完全注释的基因组，最近的一项估计表明，其4623个基因中有35%缺乏功能的实验证据(即“y基因”)。大肠杆菌编码蛋白质的完整注释对于完整描述其代谢能力以及理解大肠杆菌在人类肠道中的作用是至关重要的。研究者利用SSNs鉴定ydj基因簇中与y基因编码相似的酶;预测一个潜在的通路，然后筛选可能的底物，这一分析发现了部分通路始于D-glycero-L-manno-oct-7-ulosonate。这个分子被核糖激酶YdjH磷酸化，然后被II类醛缩酶YdjI裂解，产生二羟基丙酮磷酸(DHAP)和L -阿拉伯酸盐，而D-glycero-L-manno-oct-7- ulosonate的产生和L- arabinurate的命运都是未知的。不管怎样，这些初步研究为继续在ydj集群中注释糖代谢基因提供了基础(图2b)。
3.3 5-脱氧-D-核糖
S-腺苷- L-蛋氨酸(SAM)超家族的成员催化一系列不同的反应，这些酶利用SAM引发复杂的依赖自由基的反应，并经常产生5-脱氧腺苷作为副产物，它被水解生成5-脱氧-d -核糖(dRib)，SAM酶家族存在于生命的所有领域，虽然dRib可以被排泄，但没有分解代谢或循环步骤被描述出来。假设dRib分解途径可以反映类似脱氧糖的分解代谢，分析细菌基因组，发现未鉴定的激酶、异构酶和醛缩酶基因簇；遵循类似的化学逻辑，基于苏云金芽孢杆菌的一个基因簇特性就能发现了一个可将dRib转化为DHAP和乙醛的dRib分解通路。后来的研究发现，红色红杆菌和大肠杆菌利用同样的三种酶来循环同样依赖的两种酶的副产物:dRib和S -甲基-5-硫代-D-核糖(图2c)。
3.4 戊糖和脱氧己糖的细菌非磷酸化分解代谢
如上所述，许多戊糖和6-脱氧己糖的分解代谢途径使用一种常见的磷酸化生化逻辑来产生DHAP和乙醇醛(戊糖)或乳酸醛(6-脱氧己糖)，例如，E. coli K-12中的D -阿拉伯糖和L-海藻糖分解代谢；然而，最近有研究发现戊糖和6-脱氧己糖的非磷酸化的细菌分解途径。在这些途径中，吡喃糖被转化成相应的醛糖酸酯(糖酸)，而有机体Herbaspirillum huttiense IAM15032编码一个糖酸脱水酶，编码三种新的铁依赖糖酸脱水酶，能够使得L-arabinate, D- arabinate和D-xylonate脱水(图2d)。这些依赖铁的糖酸脱水酶中的一种倾向于D -阿拉伯酸，但容易脱水其他糖酸，具有相同的C2和C3立体化学(图2d)。这种无序性使得H. huttiense不仅可以利用D -阿拉伯酸，还可以利用其他五种糖酸作为唯一的碳源。这些生成的2-酮-3-脱氧糖酸遵循两种途径之一:导致戊糖第二次脱水和氧化生成a-酮戊二酸(aKG)的II路途径或导致酒精氧化的III路途径，C-C键水解生成丙酮酸，戊糖或L-fucose分别生成乙醇酸或乳酸(图2d)，这种代谢策略允许这些生物体使用较少的基因来实现结构相似的糖的分解代谢。
4. 酶促糖化学的新机制
4.1 空肠弯曲杆菌荚膜多糖的生物合成
致病菌空肠弯曲杆菌能够利用其荚膜多糖(CPS)中的庚糖D-glycero-L-gluco-heptose（该分子来源于戊糖磷酸途径的 D-altro-heptulose-7P） ，通过与嗜热嗜氧动脉瘤杆菌DSM 10155类似的途径产生GDPD-glycero-a-D-manno-heptose(GDP-DgDm)(图3a)。研究者对GDP-DgDm生物合成酶的SSN分析发现，484株空肠梭菌中有373株编码同源基因，这些菌株利用了含庚糖的CPSs。在对空肠弯曲杆菌NTCC 11168中这些必需活性进行验证后，研究者们又通过氧化、外异构化和还原将GDP-DgDm转化为GDP-Dglycero- L-gluco-heptose。之前的工作确定了最后两个步骤，但最近的工作确定了将GDP-DgDm氧化为GDP-D-glycero-4-keto-alpha-D-lyxo-heptose的酶(图3a)。Cj1427是短链脱氢酶超家族成员之一，在CPS生物合成基因簇中发现，虽然此前曾检测过这种反应，但研究者通过类似的SSN分析和CPS结构定位，它被确定为优先级。该脱氢酶有一个不寻常的机制：NAD+辅因子与酶结合紧密,而不是在反应中释放出来。底物氧化后，NADH产物以aKG为共底物进行氧化。在另外三种酶中也发现了这种反应，尽管这些酶的序列相似性很低。
4.2 D-芹菜糖分解代谢
D-芹菜糖是一种分支戊糖，存在于植物细胞壁中的鼠李糖半乳糖醛酸- II和鼠李糖半乳糖醛酸复合体多糖中。先前的研究发现拟杆菌(Bacteroides vulgatus ATCC 8482)和拟杆菌(Bacteroides dorei DSM 17855)可以分解 D-芹菜糖。研究者通过筛选SBPs发现D-芹菜糖特异性转运体和D-芹菜糖的分解途径，然后对D-芹菜糖特异性的SBPs进行了鉴定，通过SSN分析发现了相似的蛋白。对局部编码基因的分析利用了发现的四种不同的假定分解途径，该分析涉及到11种新酶的功能表征，包括3种具有新功能的酶(图3b)。第一个新反应是D-芹菜糖的羟基甲基通过氧化异构酶ApnO迁移生成3-oxo-isoapionate；第二步是3-oxo-isoapionate-4P 脱羧，通过OiaD生成 L-erythrulose-1P and CO2；第三步是在OiaT(也是一种类似rubisco的蛋白)的催化下，将相同的3-oxo-isoapionate-4P 进行转羧化和水解，得到乙醇酸和3-磷酸-D-甘油酸。
4.3 L-抗坏血酸分解代谢
L-抗坏血酸(维生素C)是植物和哺乳动物中普遍存在的抗氧化剂；细菌的分解代谢途径以大肠杆菌K-12为代表。Ralstonia eutropha H16 ATCC 17699(重命名为Cupriavidus necator)也可以利用l -抗坏血酸作为唯一的碳源，但其基因组不包括编码E, coli途径的基因。当机体在 L-抗坏血酸上生长时，RNAseq定量转录本表达上调；SSN分析发现了一组候选基因，能够将L-抗坏血酸转化为aKG(图3c)。这种分析使得两种酶的注释具有独特的机制。其中一种反应是由DkgM催化的，而DkgM不是表征家族的成员，它催化二苯基酸重排，将二酮转化为a-羟基内酯；第二种反应由ClxD催化，是第一个依赖NAD的脱羧酶，它对双二羧酸进行单一和立体特异性的脱羧。
（a）空肠弯曲菌中的庚糖生物合成包括需要再生NAD +辅因子的脱氢酶。（b）D-Apiose分解代谢涉及氧化异构酶，催化呈橙色的羟甲基迁移。RuBisCO超家族的两个成员在同一底物上执行不同的化学反应，导致红色的羧酸酯基团脱羧或转羧。（c）R. eutropha H16的L-抗坏血酸分解代谢包括DkgM催化的苯甲酸重排和NAD +依赖性ClxD催化的单个立体有择脱羧作用，导致L-抗坏血酸C2在该途径中损失。（d）通过R.gnavus从糖基化粘蛋白中去除Neu5Ac，得到2，7-脱水Neu5Ac。该糖通过假设的氧化中间体通过不消耗该辅因子的NAD +依赖性酶转化为Neu5Ac。
结论
最新发布的UniProtKB 包括188,961,949个蛋白质，可能有25%通过直接研究或序列相似性与表征的同源物进行了可靠的注释（尽管这几乎肯定是高估了，因为会有不正确的注释，这在很大程度上是因为无法正确地确定函数之间的序列边界）。大数据问题可以利用SSN来识别未特征的酶家族，基因组背景可以用来为代谢途径的假说提供信息，该策略可以从不同的点开始，比如分析多糖利用位点，以寻找在石莼多糖代谢中的新酶，根据预测的生化逻辑查找基因组以发现5-脱氧-D-核糖循环，或通过整合通路映射进行计算预测，用于发现L-古洛糖酸分解通路。期望研究者们能够继续利用SSN、GNN和其他工具对“基因组暗物质”研究并协助识别新的代谢途径。