Calca基因敲除小鼠构建技术原理
Calca基因
该基因通过对基因转录本的RNA选择性剪接和非活性前体蛋白的切割，编码肽激素降钙素、降钙素基因相关肽（CGRP）和卡他钙素。降钙素参与钙的调节，并发挥调节磷代谢的作用。降钙素基因相关肽具有血管扩张剂和抗菌肽的功能，卡他钙素是一种降钙肽。
CGRP广泛表达于中枢和外周神经系统，参与多种生理过程，包括外周血管舒张、烟碱乙酰胆碱受体（AChR）的合成、睾丸下降、痛觉感受、碳水化合物代谢、胃肠运动、神经源性炎症和胃酸分泌。
图1. CALCA基因以组织特异性方式产生降钙素和α-降钙素基因相关肽（CGRP）[1]
Calca基因敲除小鼠表型
Hoff等人通过同源重组的方式采用Neo取代Calca基因的2-5号外显子，达到基因缺失的目的。[2]
图2. 创建Calca基因缺失的小鼠[2]
1 钙代谢
在纯合Calca敲除（KO）和野生型（WT）小鼠之间，血清钙、离子钙、磷、完整甲状旁腺激素（PTH）、甲状腺素和1,25-二羟基维生素D3 （1,25-D3） 没有差异。
表1. 雌性小鼠钙代谢参数的基线生化分析[2]
采用 hPTH（人甲状旁腺激素，0.5 μg/g 体重）处理KO和WT小鼠：KO小鼠 在注射hPTH2小时和4小时后，血清钙和尿脱氧吡啶啉（DPD）浓度显着增加，WT小鼠没有明显变化（图3a）。实验中血清降钙素（CT） 的平行测量显示WT小鼠血清CT显着增加，而KO小鼠血清CT没有升高（图3b）。对此的一种合理解释是，用PTH处理的WT小鼠中血清CT的升高阻止了破骨细胞介导的骨吸收和随后的血清钙水平的升高。在注射hPTH前立即进行CT预处理，剂量为10至100 pg/g时，可抑制PTH介导的血清钙浓度升高（图3c），从而防止高钙血症反应。
图3. 甲状旁腺激素刺激的骨吸收在KO小鼠中引起高钙血症，并被CT给药阻断[2]
2 骨的X线摄影和组织形态测定
椎体和胫骨通过X线摄影结果显示：1个月和3个月大的雌性KO小鼠的骨密度高于同龄的雌性WT小鼠。组织学分析显示，雌性KO小鼠在1个月和3个月时椎体骨小梁体积显著增加，在3个月时胫骨近端骨小梁体积显著增加（图4a）。经组织形态分析证实，KO雌性小鼠骨体积和骨小梁数量显著增加（图4b）。WT和KO小鼠的小梁厚度相同，而KO小鼠的小梁间距显著降低。
图4. Calca基因KO导致小鼠骨骼增加[2]
3 感染模型
13年的一项研究对 Calca敲除小鼠（KO）和WT小鼠进行肺炎链球菌或铜绿假单胞菌的感染，使用滴定浓度导致20-80%的WT小鼠死亡，从而可以检测到KO相对于WT小鼠的生存增加或减少。感染肺炎链球菌的KO小鼠多数在第3天死亡，感染铜绿假单胞菌的小鼠多数在第2天死亡，少数在第4天死亡，总生存期为7天。在革兰氏阳性（肺炎链球菌）感染下， WT小鼠的7天存活率为3/13 （23%），KO小鼠为3/14 （21.4%）。在革兰氏阴性（铜绿假单胞菌）感染下， WT小鼠的7天存活率为2/10 （20%），KO小鼠为2/11 （18.2%）。在任何革兰氏阳性或革兰氏阴性肺炎感染中，WT小鼠和KO小鼠的存活率没有显著差异。
图5. 野生型（WT）和Calca敲除（KO）小鼠对肺炎感染的反应[3]
肺炎链球菌感染24小时后，WT小鼠血清降钙素/降钙素原（CT/PCT）免疫反应增强2.1倍，但在KO小鼠中未检测到。该研究还使用CT的标准放射免疫分析法对样品进行了分析：WT小鼠基线时可检测到血清 CT/PCT 免疫反应性，在甲状旁腺激素刺激后升高4.4 倍，在肺炎链球菌感染24小时后升高 2.6 倍，但在任何这些条件下的KO小鼠中都检测不到血清CT/PCT免疫反应。
图6. 野生型（WT）和Calca敲除（KO）小鼠对肺炎感染的反应[3]
以上数据说明：由于感染和炎症期间非内分泌PCT表达较低，KO小鼠不是测试PCT在败血症发病机制中作用的理想功能丧失模型。
研究表明Calca基因不是生殖所必需的，它的缺失与任何严重的发育缺陷无关，并且它似乎不会影响基础钙或其他矿物质稳态。然而，如果仔细观察，就会发现CT在正常骨和矿物质稳态中的作用。缺陷小鼠对外源性PTH给药的反应性增强；进一步的分析表明，破骨细胞数量或骨吸收标志物 （DPD） 没有差异，而骨形成率显着增加。KO小鼠意外发现的骨形成增加表明Calca基因产物对骨形成调节的作用未被认识。鉴于受损的骨再生影响很大比例的骨折患者，在机械水平上了解骨折愈合并确定主要影响骨再生的介质具有高度的临床和科学重要性。鉴于CGRP受体与细胞表面结合，使其成为极好的药物靶点，选择性CGRP激动剂可能被证明是治疗受损骨折愈合的潜在药理学方法。[4]
参考文献：
(1) Raynaud A, Cohen R, Modigliani E. Le peptide alternatif du gène de la calcitonine （CGRP） [Calcitonin gene-related peptide （CGRP）]. Presse Med. 1994 Feb 5;23（4）:171-5. French. PMID: 8177860.
(2) Hoff AO, Catala-Lehnen P, Thomas PM, Priemel M, Rueger JM, Nasonkin I, Bradley A, Hughes MR, Ordonez N, Cote GJ, Amling M, Gagel RF. Increased bone mass is an unexpected phenotype associated with deletion of the calcitonin gene. J Clin Invest. 2002 Dec;110（12）:1849-57. doi: 10.1172/JCI14218. PMID: 12488435; PMCID: PMC151647.
(3) Tuvim MJ, Clement CG, Huang ES, Cote GJ, Evans SE, Lei X, Deftos LJ, Gagel RF, Dickey BF. Deletion of the gene encoding calcitonin and calcitonin gene-related peptide α does not affect the outcome of severe infection in mice. Am J Respir Cell Mol Biol. 2013 Jul;49（1）:151-5. doi: 10.1165/rcmb.2012-0489OC. PMID: 23526213; PMCID: PMC3727888.
(4) Appelt J, Baranowsky A, Jahn D, Yorgan T, Köhli P, Otto E, Farahani SK, Graef F, Fuchs M, Herrera A, Amling M, Schinke T, Frosch KH, Duda GN, Tsitsilonis S, Keller J. The neuropeptide calcitonin gene-related peptide alpha is essential for bone healing. EBioMedicine. 2020 Sep;59:102970. doi: 10.1016/j.ebiom.2020.102970. Epub 2020 Aug 24. PMID: 32853990; PMCID: PMC7452713.