DNA测序技术的发展史之——第二代测序技术

2016-11-30 11:55:55

        经过几十年的改进，第一代测序仪不仅在读长上有较大的突破，准确率高达99.999%，而且测定成本也大幅下降，达到每千碱基序列为0.5美元。但是，不管怎么改进，由于对电泳分离技术的依赖，第一代测序技术在速度和成本方面都已达到极限。在这种情况下，第二代测序技术（Next-generation sequencing）应运而生。

    第二代测序技术的核心思想是边合成边测序（Sequencing by Synthesis），即通过捕捉新合成末端的标记来确定DNA的序列。其特点是能一次并行几十万到几百万条DNA分子的序列测定，且一般读长较短。
    目前，第二代测序技术平台主要包括Roche/454 FLX、Illumina/Solexa Genome Analyzer和Applied Biosystems SOLID system。

Roche/454 FLX：
        2005年，454 Life sciences公司（现被Roche公司收购）首先推出了基于焦磷酸测序法的超高通量基因组测序系统——Genome Sequencer 20 System，开创了第二代测序技术的先河。2007年，又推出了性能更优的第二代基因组测序系统——Genome Sequencer FLX System。
         焦磷酸测序技术是一种新型的酶联级联测序技术，可快速、准确的测定一段较短的DNA序列。

原理如下：
一个片段= 一个磁珠= 一条读长（one fragment = one bead = one read）

（1）样品输入并片段化
      

           大的样品如基因组DNA或者细菌人工染色体（Bacterial artificial chromosome，BAC）等被打断成300~800 bp的片段；对于小分子的RNA或者PCR扩增产物，可直接跳到步骤3。

（2）文库制备：
      借助一系列分子生物学技术，将A和B接头（3’和5’端具有特异性）连接到DNA片段上，接头用于后续的纯化、扩增和测序步骤。具有A、B接头的单链DNA片段组成了样品文库。

（3）一个DNA片段=一个磁珠：
     

 

       单链DNA文库被固定在特别设计的DNA捕获磁珠上。每一个磁珠携带一个独特的单链DNA片段。磁珠结合的文库被扩增试剂乳化，形成油包水的混合物，这样就形成了只含有一个磁珠和一个独特片段的微反应器。

（4）乳液PCR扩增：

        每个独特的片段在自己的微反应器中进行独立的扩增，而没有其他的竞争性或者污染性序列的应先。整个片段文库的扩增平行进行。对于每一个片段而言，扩增后产生了几百万个相同的拷贝。随后，乳液混合物被打破，扩增的片段仍然结合在磁珠上，既可被回收纯化，又可用于后续的测序实验。

（5）一个磁珠 = 一个读长：
       携带DNA的磁珠放入PTP板（每孔容纳一个磁珠）中进行后续的测序。J将PTP板放置在GS FLX中，测序开始。放置在四个单独的试剂瓶里的四种碱基，依照T、A、C、G的顺序依次循环进入PTP板，每次进入一个碱基。

        如果发生碱基配对反应，则释放一个焦磷酸。这个焦磷酸在酶的作用下，最终将荧光素氧化成氧化萤光素，同时释放出光信号。该信号实时被仪器配置的高灵敏度CCD捕获到。一个碱基配对就会有一分子的光信号，由此可以准确、快速的确定待测模板的碱基序列。

（6）数据分析：
        GS FLX系统提供两种不同恶生物信息学工具对测序数据进行分析，适用于不同的应用：达到400 MB的从头拼接和任何大小基因组的重测序。

       Roche/454 FLX 的准确率在99%以上，读长可高达400 nt。但也存在限制，主要是来自同聚物的连续掺入，如AAA或GGG，由于没有终止元件阻止单个碱基的连续掺入，同聚物的长度就需要从信号强度中推断，这个过程就会出现一定误差。