Cell | 肿瘤特异性巨噬细胞亚群在术后富集，与复发风险相关 / 四六文摘

撰文：知否

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研究者通过将scRNA-seq技术和VIPER蛋白质活性分析算法相结合，对ccRCC肿瘤组织以及癌旁组织的微环境进行分析，发现了肿瘤细胞特异性的TREM2/APOE/C1Q阳性巨噬细胞亚型，这些上调的基因是ccRCC复发的潜在预后生物标志物，也可作为候选的治疗靶标。

肾癌是癌症免疫疗法最敏感的恶性肿瘤之一。肾透明细胞癌(ccRCC)是一种异质性疾病，占肾实质癌的85%。尽管可以通过手术切除瘤体治疗，但仍旧有40%会复发最终发展为转移癌。迄今为止，对原发性ccRCC肿瘤微环境(TME)最全面的研究是使用飞行时间流式细胞术(CyTOF)检测先天和适应性免疫的标记物。这些研究表明，T细胞衰竭标记物和CD38骨髓样细胞浸润的表达与较差的预后相关。基于单细胞的高通量RNA测序(scRNA-seq)，可以对包括TME的不同细胞亚群进行分类，并能够识别具有代表性的基因表达特征。与大量RNA-seq相比，scRNA-seq可以描述单个细胞类型的转录状态，突出稀有群体的作用，其基因表达特征将被稀释到大样本检测到的范围以下。与流式细胞术或细胞图相比，scRNA-seq生成每个细胞转录组的全基因组轮廓，而不需要选择预定义的标记。scRNAseq的价值已在最近的黑色素瘤研究中体现，但是目前还没有靶向ccRCC的系统性的单细胞研究。然而scRNA-seq的一个关键技术局限是基因表达谱非常稀少，在每个细胞中约有80%–90%基因没有被检测到，这一现象被称为“基因缺失”（gene dropout）。虽然这些数据可以有效地描述分子不同的细胞亚群，但它们不太适合研究特异性基因，也可能无法检测到更细微的差异，因此需要一种方法来解决这种重要基因可能被遗漏的问题。最近，在Cell杂志上发表了一篇题为“Single-cell protein activity analysis identififies recurrence-associated renal tumor macrophages”的文章，研究者通过对未经治疗的ccRCC切除的肿瘤和癌旁组织进行scRNA-seq分析，再利用VIPER算法来定量单细胞蛋白的活性，发现了一个肿瘤特异性的TREM2/APOE/C1Q上调的巨噬细胞亚群，并且在大型临床验证中，这些标记物在手术后复发患者的肿瘤中有显著的富集，同时作者指出这些细胞的存在可用于鉴定术后疾病复发风险高的患者。

研究者从11例未经治疗的切除肿瘤及邻近正常组织中分离出二十多万个活细胞进行scRNA-seq，按照UMAP降维后可视化，并使用Seurat-Louvain算法进行聚类，随后使用VIPER进行基于蛋白质活性的聚类，并通过高参数光谱流式细胞仪对VIPER结果进行了全面验证。该分析确定了关键的TME亚群及其主要调控因子和候选细胞之间的相互作用，从而揭示了临床相关人群（这些人群无法通过基因表达分析检测到）。对于每个单个细胞，研究者使用簇特异性调控网络来执行基于VIPER的蛋白质活性推断。虽然得到的簇通常与通过基因表达得到的簇一致，但基于蛋白质活性的簇显示出多重关键差异。通过整合转录组学和基于VIPER的蛋白质组学数据，研究者描述了不同亚群、关键调节蛋白和候选配体/受体介导的相互作用，蛋白质活性分析鉴定了巨噬细胞的一个新的肿瘤特异性亚群及其差异活性蛋白（即LILRB5、APOE和TREM2）和差异表达基因（即C1QA-C、APOE和TREM2）。值得注意的是，如果使用了基于基因表达的聚类所产生的聚类结构，这些基因的差异表达将不会被发现。随后研究者们验证了通过免疫荧光分析鉴定的肿瘤特异性巨噬细胞标记蛋白，并将这些数据与临床结果相关联。

随后，作者通过免疫荧光染色（IF）相关的巨噬细胞种群标记是否通过免疫荧光染色在细胞中共同表达，并分析它们的空间定位，以确定这些标记是肿瘤、T细胞，还是巨噬细胞相关。特别关注C1Q、APOE和TREM2这些与临床结果密切相关的蛋白活性标记物。因为后两者被识别为与临床结果密切相关的蛋白活性标记物，C1Q高度过表达，但只能在单细胞数据的VIPER分群类别后被识别。

为了进一步评估与疾病复发的关联，研究者从用于初始批量RNA-seq研究的相同数据集中染色了样本。这些样本表明，与无复发的患者相比，TREM2和C1Q在肿瘤基质中显著富集。特别是C1Q巨噬细胞与疾病复发显著相关（p=0.028）。这些数据表明，通过IF评估肿瘤内C1Q巨噬细胞密度可能为复发提供一个有用的预后生物标志物。此外，由基因集富集分析(GSEA)分析定义的疾病复发Kaplan-Meier曲线，并独立支持肿瘤浸润性巨噬细胞密度与术后复发的联系，突出了IF染色和scRNA-seq分析之间的强一致性。

综上所述，该研究报告了一种新的、可广泛推广的scRNA-seq分析的开发和应用，该通过VIPER蛋白质活性分析的补充，进而能够全面剖析TME中亚群的组成部分，揭示了这种富含于ccRCC的C1Q/TREM2/APOE/上调的巨噬细胞亚群。虽然该研究的分析集中在治疗-单纯的透明细胞肾癌上，但作者认为这种方法可以有效地应用于任何感兴趣的肿瘤，并可能应用于其他基于组织的研究。虽然本研究中的scRNA-seq数据受病例数量相对较少的限制，但研究者累积分析了高数据质量的>200,000个细胞，并且患者识别的人群非常一致，表明其他患者不会对研究结论产生显著影响。大量数据和qmIF研究中单细胞特征的富集表明，C1Q表达的巨噬细胞亚群的肿瘤浸润与疾病复发之间有强烈的和统计学上显著的联系，因此或许可以作为辅助治疗的合适候选。

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