新型冠状病毒在全球大流行，严重威胁人类的生命安全，同时给世界各国的医疗环境带来了严重冲击。早发现，早报告，早隔离，早诊断是遏制疫情传播的有效手段。今天给大家带来用于SARS-CoV-2检测的成本低、灵敏度高的方法，分别为基于多等位基因分子信标的实时RT-PCR检测以及咽喉冲洗液和鼻咽拭子中SARS-CoV-2 RNA的高灵敏度池检测。具体内容如下。（一）基于多等位基因分子信标的实时RT-PCR检测，可用于检测SARS-CoV-2
新型冠状病毒SARS-CoV-2的出现及大流行、甚至发生变异，无疑给针对敏感性和特异性的检测技术带来了挑战。来自塞浦路斯大学Chrysostomou A等人进行了一项关于“A Multi-Allelic Molecular-BeaconBased Real-Time RT-PCR Assay for the Detection of the Coronavirus SARSCoV-2 from Clinical Samples”的研究，该研究提出了一种基于多等位基因分子信标（MB）的实时RT-PCR检测SARS-CoV-2的方法（基于美国专利7709188B2），同时考虑到了其由于遗传漂变和重组而产生的内在多态性，以及将遗传上不同的菌株连续和多次引入人群中的可能性。用于该分析的MB、引物和目标扩增子是从头创建的，用于检测SARS-CoV-2的S、N、M和E基因片段。并利用S、N、M和E基因的寡核苷酸片段设计了内部阳性对照（IPC）。通过mfold DNA折叠程序研究每个MB的折叠和结构以及其热力学细节。除E和IPC分别用TET和FAM标记外，其余MBs均在3'端用DABCYL标记，5'端用HEX标记。每个MB的茎段为6个核苷酸（nts），GC含量很高，而loop为24~26个nts，设计为具有错配耐受性（仍然可以检测多态性替换），并且与待扩增的基因片段互补。研究者通过IDT Oligo Analyser webtool检测引物和MB的热力学相容性和二聚体形成；进行熔解曲线分析以评估每种MB的热力学特性；通过MEGAscript T7转录试剂盒进行体外转录，为每个基因开发合成RNA转录物，并用作阳性对照；最后采用TaqPath一步法RT-PCR混合物完成实时RT-PCR分析。该检测使用在细胞培养中生长的冠状病毒株“BetaCoV/Germany/BavPat1/2020 p.1”的纯化RNA进行检测，其中MBs正确识别了每个基因。同时，该检测还得到了世界卫生组织（WHO）和分子诊断质量控制（QCMD）的两个SARS-CoV-2外部质量评估（EQA）小组的验证。这些小组的样本具有不同的冠状病毒株和病毒载量，从阴性、临界阳性到高度阳性。该检测显示100%成功识别了所有6个WHO小组样本和所有8个QCMD样本。在进行SARS-CoV-2监测的前提下，塞浦路斯大学使用该检测（经生物伦理学批准）对学生和工作人员的合并鼻咽样本进行诊断测试。最终，对2231例个体的534个集合样本（平均每个集合5个样本）进行了测试。阳性库中的个体被召回进行测试，其中16人被确定为阳性。综上所述，通过本项研究，研究者建立了一种高效、重复性好的实时RT-PCR检测方法，并通过EQA、参考样本和公共诊断监测进行了验证。该方法具有较高的准确性和特异性，可用于SARS-CoV-2和其他新出现的突变病原体的检测。参考资料:Chrysostomou A, Hezka Rodosthenous J, Topcu C, et al. A Multi-Allelic Molecular-BeaconBased Real-Time RT-PCR Assay for the Detection of the Coronavirus SARSCoV-2 from Clinical Samples. European Meeting on HIV & Hepatitis 2021. Abstract 20.（二）咽喉冲洗液和鼻咽拭子中SARS-CoV-2 RNA的高灵敏度池检测
SARS-CoV-2大流行对检验和临床来说是一个挑战。尤其是在卫生保健环境中，监测无症状获得性感染是降低医护人员和患者风险的重要手段。由于核酸检测（NAT）成本高、NAT和拭子检测能力有限以及即时抗原检测敏感性不足，因此对于新方法的需求迫在眉睫。虽然已经有可在一个NAT测试中对多个样本进行池检测的方案，但其中许多方案的灵敏度都有所下降，甚至不允许池的解析。基于此，Dusek M等人开发了一种池检测，它既具有高灵敏度，又能从不同的材料中解析池，包括简单的自己做样品收集的洗喉方法。
最佳池大小按每个池10个样本计算。检测时，各取200 μL样本混合，总体积2 mL，添加合成RNA；在24孔Kingfisher flex系统上进行大容量核酸提取和浓缩；用移液管将上一步的25 μL洗脱液与含有E基因/RdRP基因和内部对照的引物和探针的25 μL PCR预混液混合；设立阴性对照。除了阳性对照和进一步处理对照之外，一次PCR可检测总共920个样品。研究者共测试了2030多个池，样本超过20 000个。75个阳性池被解析为77个阳性样本。合并样本与ct值最低的阳性样本之间ct值的平均差异为0.24。对于合并的咽喉冲洗液和鼻咽拭子，未观察到性能差异。综上所述，在低流行率监测环境中（如非SARS-CoV-2病房的医护人员），高灵敏度池检测可以快速、经济有效地筛查SARS-CoV-2无症状感染。这种方法可以在无需大量投资的情况下提高PCR检测能力，因此采用这种高灵敏度方法进行常规筛查也更经济实惠。
参考资料：Dusek M, Ehret R, Obermeier M. High sensitivity pool testing for SARSCoV-2 RNA from throat wash and nasopharyngeal swabs. European Meeting on HIV & Hepatitis 2021. Abstract 4.
