【生化】Angew：用于肿瘤自然杀伤细胞活性成像的化学发光探针
自然杀伤（NK）细胞是可以杀死某些类型癌细胞的免疫细胞。其不仅与抗肿瘤、抗病毒感染和免疫调节有关，而且在某些情况下还参与超敏反应和自身免疫性疾病的发生。NK细胞的过继转移是一种针对恶性肿瘤的新型免疫疗法，识别靶细胞后，其可使细胞溶解的颗粒酶释放到靶细胞，从而诱导细胞凋亡。NK细胞的抗肿瘤能力可以通过多种方式进行体外监测。然而，迄今为止，几乎没有化学探针可以直接检测体内肿瘤中的NK细胞活性。
基于此，英国爱丁堡大学的Marc Vendrell教授和Takanori Kitamura博士以及以色列特拉维夫大学的Doron Shabat教授合作报道了一种新型化学发光探针，其可用于颗粒酶B介导的NK细胞对癌细胞的杀伤活性研究中的原位成像。其中颗粒酶B特异性底物通过自消灭性接头与可活化的苯氧基二氧杂环丁烷发光体偶联，仅在存在NK细胞释放的活性颗粒酶B的情况下才能产生化学发光（Scheme 1）。相关成果以“A Functional Chemiluminescent Probe for in vivo Imaging of Natural Killer Cell Activity against Tumours”为题发表在Angew. Chem. Int. Ed.上（DOI: 10.1002/anie.202011429）。
（来源：Angew. Chem. Int. Ed.）
首先，作者基于颗粒酶B的底物-序列Ile-Glu-Pro-Asp（IEPD）设计了化学发光探针1，其主要由三部分组成：颗粒酶B可裂解的肽序列Ac-IEPD、含亲电酰胺键的对氨基苄醇（PABA）桥连基团和用于化学发光的苯氧基二氧杂环丁烷。1的具体合成过程如Scheme 2所示：天冬氨酸与谷氨酸的侧链被保护为烯丙基酯，从而使C末端的羧基游离出来；使用N-乙氧基羰基-2-乙氧基-1,2-二氢喹啉（EEDQ）将羧基与PABA的苯胺基偶联，得到化合物2；用氯代三甲基硅烷和碘化钠处理2，得到具有更高反应活性的化合物3；3与丙烯酸取代的酚烯醇醚反应得到受保护的前体4；在Pd(PPh3)4和二甲基巴比妥酸（DMBA）的脱保护作用下，得到粗产品；最后，经HPLC纯化，得到化学发光探针1，纯度高达95%以上。
（来源：Angew. Chem. Int. Ed.）
随后，作者探究了在存在及不存在活性人重组（hr）-颗粒酶B的情况下，探针1的化学发光现象与时间的关系，发现探针1与酶孵育后几分钟内在520 nm附近出现强烈的化学发光（Figure 1a）。作者进一步将探针1在颗粒酶B抑制剂Ac-IEPD-CHO存在下与活性酶孵育，发现化学发光降低了90％以上，表明探针1的激活是由于其与颗粒酶B的反应性所致（Figure 1a）。另外，作者评估了探针1对颗粒酶B的选择性，结果显示在与颗粒酶B反应后不到10分钟内化学发光增加了139倍，而在其他蛋白酶存在下化学发光变化很小，仅在半胱天冬酶8和生物分子中检测到信号（Figure 1b）。
（来源：Angew. Chem. Int. Ed.）
接下来，作者比较了探针1与具有相同肽序列的可激活荧光探针的灵敏度。市售荧光探针Ac-IEPD-AMC含有7-氨基-4-甲基香豆素基团，经颗粒酶B裂解后在450 nm处产生荧光（Figure 2a）。与活性颗粒酶B反应30分钟后，作者测量了探针1和Ac-IEPD-AMC的信噪比（S/N），发现探针1的信噪比远高于Ac-IEPD-AMC，并在不到10分钟的时间内达到了约100倍，而Ac-IEPD-AMC的比率始终低于5倍（Figure 2b）。
（来源：Angew. Chem. Int. Ed.）
鉴于探针1良好的体外实验结果，作者在PhotonImager™发光成像系统下研究了其是否可用于检测颗粒酶B介导的NK细胞对癌细胞的杀伤活性。作者将细胞孵育不同的时间，然后添加探针1并进行免洗图像采集（Figure 3a）。探针1在单独的NK-92细胞和人乳腺癌细胞MDA-MB-231中均显示出很低的发射；但在NK-92和MDA-MB-231共孵育细胞中检测到明亮的化学发光（Figure 3b）。与NK细胞的抗癌活性相一致，作者观察到探针1的化学发光随着共孵育时间的增加而增加，且在8小时后检测到最亮的信号（Figure 3c）。
（来源：Angew. Chem. Int. Ed.）
最后，作者检查了探针1在体内成像NK细胞活性的能力。NSG小鼠缺乏宿主NK细胞，因此可作为评估过继转移NK-92细胞效力的最佳模型。首先，作者向免疫受损的NSG小鼠注射人MDA-MB-231癌细胞，构建了异种移植小鼠癌症模型，该模型中动物的两个侧面均接种了皮下肿瘤。随后，作者将NK-92细胞仅注射到其中一个肿瘤。待NK细胞转移八小时后，作者将探针1应用于两个肿瘤，并立即在PhotonImagerTM系统中进行全身成像。结果显示，仅在接受NK细胞注射的肿瘤中检测到明亮的化学发光信号。另外，在未注射探针1的小鼠中同样没有检测到信号（Figure 4）。
（来源：Angew. Chem. Int. Ed.）
总而言之，作者开发了一种新型化学发光探针1，其可用于快速且选择性检测NK细胞活性，以识别肿瘤细胞，并且其在速度和信噪比方面优于商业荧光试剂Ac-IEPD-AMC并可用于定量检测。此外，使用全身化学发光成像系统能够实现在体内可视化NK细胞识别的肿瘤。这项研究强调了可激活的化学发光探针在活体肿瘤中直接监测基于NK细胞的免疫疗法的有效性。