【前沿技术】CRISPR/dCas9技术带你玩转分子互作 2024-07-30 22:56:07 科研讲坛期刊,实验,科研心得—— 每天聊点与科研有关的事儿大家好,我是喜欢每天挖点实用技术的无花果~不知道大家有没有发现,最近几年有一项技术非常火爆,相信科研圈的小伙伴们都不陌生,那就是CRSPR-Cas9技术。自从2012年CRISPR-Cas9系统首次被用于DNA的精准编辑以来,在短短几年时间内迅速走红科研圈,被广泛应用于多个物种细胞、个体的基因敲除,随后衍生出的不同CRISPR-Cas系统更是实现了基因的敲减、敲入、激活以及RNA的编辑,开启了基因精准编辑的新纪元,自此基因编辑进入了CRISPR时代。然而你以为CRISPR-Cas系统只能用于核酸编辑?NoNoNo......只需简单的基因工程改造,就能利用CRISPR/Cas进行DNA、RNA互作分子的挖掘和筛选。 今天要为你介绍的dCas9-ChIP技术就是对Cas9蛋白进行一些位点突变,与ChIP联用实现核酸的富集以及DNA-RNA-蛋白的互作验证。话不多说,先上文章。 这篇2020年发表在《Journal of Hematology & Oncology》(影响因子5年内从5升到11,真是潜力股啊)上的文章为了研究lncRNA HUMT与转录因子YBX1共同调控FOXK1转录表达的机制,就用到了这项看似高大上,实则接地气的技术。以往如果我们想要证明lncRNA与转录因子结合调控基因表达的分子机制,常常需要以下几个步骤:1、RIP、RNA-pull down实验先证明lncRNA与转录因子互作;2、ChIP实验证明转录因子结合基因的启动子;3、DNA-RNA杂交(Northern blot)证明lncRNA与基因启动子结合。这样做实验不仅耗时耗力,还非常烧经费。有的同学会说,那就用ChIRP(与ChIP对应,一种验证RNA、蛋白和DNA结合的免疫共沉淀技术),可以通过生物素标记的RNA探针结合目标RNA,直接把蛋白和启动子DNA一起沉淀下来。但是,如果lncRNA不直接结合启动子DNA序列,只是辅助转录因子结合的呢?这时dCas9-ChIP就可以闪亮登场了。 Cas9蛋白结构示意图[1]说到这项技术,首先要来说说什么是dCas9。众所周知,我们常用的Cas9蛋白分为几个结构域:结合sgRNA的REC结构域,PI结构域以及负责DNA切割的HNH和RuvC结构域(如上图所示)。如果将HNH和RuvC的切割位点突变又不改变蛋白质的整体结构,那么就可以实现Cas9仅被sgRNA招募到DNA上结合,而不行使编辑功能。如果进一步在Cas9的一端融合表达标签或荧光蛋白(Flag、GFP等),那我们就可以实现用标签抗体将Cas9结合的DNA以及DNA上结合的分子全部沉淀下来的目的。这一被改造后失去切割活性的Cas9蛋白就被命名为dCas9(deficient Cas9)。 dCas9-ChIP技术示意图[2]说回到这篇文章,作者首先设计靶向位点的sgRNA,再和dCas9-Flag一同转入细胞,然后按ChIP的方法将细胞交联后裂解,用带有Flag标签抗体的Beads将dCas9连同交联在一起的所有分子都沉淀下来,最后将DNA/RNA/蛋白质解交联并分别提取,进行 RT-qPCR、Western blot 或测序/芯片/质谱分析,就可以定量检测目标RNA/蛋白含量,或是寻找未知的结合分子。看似复杂,实则一步到位,将所有直接或间接结合的分子全部找到。私以为这样的方法非常适合寻找特定启动子位点的结合分子,不仅操作简单、高效,转入dCas9系统的细胞还能保留下来进行后续验证实验。检测结果如下图。 RT-qPCR检测lncRNA表达,gCT和IgG为阴性对照。这样好用的方法当然不是作者独创,早在2014年弗吉尼亚大学的研究团队就利用dCas9的方法检测CRSPR/Cas9系统的脱靶率。作者将12条sgRNA和dCas9转入HEK293T细胞,并以未失活的Cas9作为对照,用常规的ChIP-seq方法检测与Cas9蛋白结合的DNA,这样就能找到CRSPR/Cas9系统在目标位点以外编辑的位置[3]。此外,由于表达丰度低,常规方法如RNA-pull down、DNA-pull down遗漏(难以捕捉到)的分子,也可以通过dCas9进行深度挖掘。2018年的1篇文章就通过类似的方法进行组蛋白基因调控因子的研究。 在PNAS上发表的这篇论文通过dCas9-sgRNA复合体找到调控组蛋白H2A的转录因子Vig和Vig2。此处的研究目标是与特定启动子结合的蛋白(转录因子),使用的是体外结合方法,操作流程与前文稍有不同。首先将细胞交联后裂解,在裂解液中加入体外表达的dCas9-sgRNA复合体,再加入FLAG标签抗体,共沉淀后纯化,洗脱结合的分子,根据需要提取DNA和蛋白,进行RT-qPCR和质谱分析(见下图)[4]。 dCas9流程示意图[4]总结一下,Cas9-ChIP技术实际上就是综合了RIP功能的高配版ChIP,通过外源的dCas9蛋白和sgRNA实现目标核酸的富集和特定位点调控复合体的检测。比起平时比较常用的RIP、ChIP、RNA-pull down、DNA-pull down技术,dCas9有以下优势:(1)省时高效,与ChIP的步骤相似,就能一次获得想要找的所有分子;(2)精准靶向,可以一次设计多条sgRNA,或使用sgRNA文库靶向目标DNA区域;(3)操作简单,只需在细胞中表达dCas9和sgRNA,就能用实验室已有的ChIP体系完成后续步骤,不同的目标DNA只需设计不同的sgRNA即可。(4)条件限制少,由于dCas9可以富集靶序列,不会受到目标序列或者结合分子丰度低的影响,能更全面地获得与靶基因结合的分子,尤其是复合体的成分。尽管dCas9确实是一个便捷好用的工具,在使用之前还是要进行合理的实验设计,保证实验能够顺利进行。首先,sgRNA的设计就要考虑以下几个方面:①需要设计几条sgRNA靶向目标基因,分别是哪几个位点;②为了避免对dCas9产生空间位阻,设计sgRNA时尽量使其结合在外侧;③sgRNA和dCas9的结合及引导效率如何,这里就需要先进行预实验确定实验条件。此外,还需根据实际情况和课题需要,选择体外结合还是细胞内交联;由于靶向的位点可能会有众多结合分子,增加假阳性率,因此设置合适而足够的对照,以及后续的验证实验非常重要。相信通过本文,你已经初步掌握了dCas9技术的原理和基本操作流程。不妨在下次探索DNA结合蛋白/RNA时考虑尝试一下这个方法,说不定会有意外的发现哦。如果你对CRISPR/Cas9技术感兴趣,欢迎在评论中留言~ 参考文献:[1] Chen Weizhong, Zhang Yifei, Yeo Won-Sik et al. Rapid and Efficient Genome Editing in Staphylococcus aureus by Using an Engineered CRISPR/Cas9 System[J]. J. Am. Chem. Soc., 2017, 139: 3790-3795.[2] Zheng Shaoquan,Yang Lu,Zou Yutian et al. Long non-coding RNA HUMT hypomethylation promotes lymphangiogenesis and metastasis via activating FOXK1 transcription in triple-negative breast cancer[J]. J Hematol Oncol, 2020, 13: 17.[3] Kuscu Cem,Arslan Sevki,Singh Ritambhara et al. Genome-wide analysis reveals characteristics of off-target sites bound by the Cas9 endonuclease[J]. Nat. Biotechnol., 2014, 32: 677-83.[4] Tsui Chiahao, Inouye Carla, Levy Michaella et al. dCas9-targeted locus-specific protein isolation method identifies histone gene regulators[J]. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 2018, 115: E2734-E2741. 赞 (0) 相关推荐 CRISPR/Cas9基因敲除技术是什么? 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