【前沿技术】CRISPR/dCas9技术带你玩转分子互作 2024-07-30 22:56:07 科研讲坛期刊,实验,科研心得—— 每天聊点与科研有关的事儿大家好,我是喜欢每天挖点实用技术的无花果~不知道大家有没有发现,最近几年有一项技术非常火爆,相信科研圈的小伙伴们都不陌生,那就是CRSPR-Cas9技术。自从2012年CRISPR-Cas9系统首次被用于DNA的精准编辑以来,在短短几年时间内迅速走红科研圈,被广泛应用于多个物种细胞、个体的基因敲除,随后衍生出的不同CRISPR-Cas系统更是实现了基因的敲减、敲入、激活以及RNA的编辑,开启了基因精准编辑的新纪元,自此基因编辑进入了CRISPR时代。然而你以为CRISPR-Cas系统只能用于核酸编辑?NoNoNo......只需简单的基因工程改造,就能利用CRISPR/Cas进行DNA、RNA互作分子的挖掘和筛选。 今天要为你介绍的dCas9-ChIP技术就是对Cas9蛋白进行一些位点突变,与ChIP联用实现核酸的富集以及DNA-RNA-蛋白的互作验证。话不多说,先上文章。 这篇2020年发表在《Journal of Hematology & Oncology》(影响因子5年内从5升到11,真是潜力股啊)上的文章为了研究lncRNA HUMT与转录因子YBX1共同调控FOXK1转录表达的机制,就用到了这项看似高大上,实则接地气的技术。以往如果我们想要证明lncRNA与转录因子结合调控基因表达的分子机制,常常需要以下几个步骤:1、RIP、RNA-pull down实验先证明lncRNA与转录因子互作;2、ChIP实验证明转录因子结合基因的启动子;3、DNA-RNA杂交(Northern blot)证明lncRNA与基因启动子结合。这样做实验不仅耗时耗力,还非常烧经费。有的同学会说,那就用ChIRP(与ChIP对应,一种验证RNA、蛋白和DNA结合的免疫共沉淀技术),可以通过生物素标记的RNA探针结合目标RNA,直接把蛋白和启动子DNA一起沉淀下来。但是,如果lncRNA不直接结合启动子DNA序列,只是辅助转录因子结合的呢?这时dCas9-ChIP就可以闪亮登场了。 Cas9蛋白结构示意图[1]说到这项技术,首先要来说说什么是dCas9。众所周知,我们常用的Cas9蛋白分为几个结构域:结合sgRNA的REC结构域,PI结构域以及负责DNA切割的HNH和RuvC结构域(如上图所示)。如果将HNH和RuvC的切割位点突变又不改变蛋白质的整体结构,那么就可以实现Cas9仅被sgRNA招募到DNA上结合,而不行使编辑功能。如果进一步在Cas9的一端融合表达标签或荧光蛋白(Flag、GFP等),那我们就可以实现用标签抗体将Cas9结合的DNA以及DNA上结合的分子全部沉淀下来的目的。这一被改造后失去切割活性的Cas9蛋白就被命名为dCas9(deficient Cas9)。 dCas9-ChIP技术示意图[2]说回到这篇文章,作者首先设计靶向位点的sgRNA,再和dCas9-Flag一同转入细胞,然后按ChIP的方法将细胞交联后裂解,用带有Flag标签抗体的Beads将dCas9连同交联在一起的所有分子都沉淀下来,最后将DNA/RNA/蛋白质解交联并分别提取,进行 RT-qPCR、Western blot 或测序/芯片/质谱分析,就可以定量检测目标RNA/蛋白含量,或是寻找未知的结合分子。看似复杂,实则一步到位,将所有直接或间接结合的分子全部找到。私以为这样的方法非常适合寻找特定启动子位点的结合分子,不仅操作简单、高效,转入dCas9系统的细胞还能保留下来进行后续验证实验。检测结果如下图。 RT-qPCR检测lncRNA表达,gCT和IgG为阴性对照。这样好用的方法当然不是作者独创,早在2014年弗吉尼亚大学的研究团队就利用dCas9的方法检测CRSPR/Cas9系统的脱靶率。作者将12条sgRNA和dCas9转入HEK293T细胞,并以未失活的Cas9作为对照,用常规的ChIP-seq方法检测与Cas9蛋白结合的DNA,这样就能找到CRSPR/Cas9系统在目标位点以外编辑的位置[3]。此外,由于表达丰度低,常规方法如RNA-pull down、DNA-pull down遗漏(难以捕捉到)的分子,也可以通过dCas9进行深度挖掘。2018年的1篇文章就通过类似的方法进行组蛋白基因调控因子的研究。 在PNAS上发表的这篇论文通过dCas9-sgRNA复合体找到调控组蛋白H2A的转录因子Vig和Vig2。此处的研究目标是与特定启动子结合的蛋白(转录因子),使用的是体外结合方法,操作流程与前文稍有不同。首先将细胞交联后裂解,在裂解液中加入体外表达的dCas9-sgRNA复合体,再加入FLAG标签抗体,共沉淀后纯化,洗脱结合的分子,根据需要提取DNA和蛋白,进行RT-qPCR和质谱分析(见下图)[4]。 dCas9流程示意图[4]总结一下,Cas9-ChIP技术实际上就是综合了RIP功能的高配版ChIP,通过外源的dCas9蛋白和sgRNA实现目标核酸的富集和特定位点调控复合体的检测。比起平时比较常用的RIP、ChIP、RNA-pull down、DNA-pull down技术,dCas9有以下优势:(1)省时高效,与ChIP的步骤相似,就能一次获得想要找的所有分子;(2)精准靶向,可以一次设计多条sgRNA,或使用sgRNA文库靶向目标DNA区域;(3)操作简单,只需在细胞中表达dCas9和sgRNA,就能用实验室已有的ChIP体系完成后续步骤,不同的目标DNA只需设计不同的sgRNA即可。(4)条件限制少,由于dCas9可以富集靶序列,不会受到目标序列或者结合分子丰度低的影响,能更全面地获得与靶基因结合的分子,尤其是复合体的成分。尽管dCas9确实是一个便捷好用的工具,在使用之前还是要进行合理的实验设计,保证实验能够顺利进行。首先,sgRNA的设计就要考虑以下几个方面:①需要设计几条sgRNA靶向目标基因,分别是哪几个位点;②为了避免对dCas9产生空间位阻,设计sgRNA时尽量使其结合在外侧;③sgRNA和dCas9的结合及引导效率如何,这里就需要先进行预实验确定实验条件。此外,还需根据实际情况和课题需要,选择体外结合还是细胞内交联;由于靶向的位点可能会有众多结合分子,增加假阳性率,因此设置合适而足够的对照,以及后续的验证实验非常重要。相信通过本文,你已经初步掌握了dCas9技术的原理和基本操作流程。不妨在下次探索DNA结合蛋白/RNA时考虑尝试一下这个方法,说不定会有意外的发现哦。如果你对CRISPR/Cas9技术感兴趣,欢迎在评论中留言~ 参考文献:[1] Chen Weizhong, Zhang Yifei, Yeo Won-Sik et al. Rapid and Efficient Genome Editing in Staphylococcus aureus by Using an Engineered CRISPR/Cas9 System[J]. J. Am. Chem. Soc., 2017, 139: 3790-3795.[2] Zheng Shaoquan,Yang Lu,Zou Yutian et al. Long non-coding RNA HUMT hypomethylation promotes lymphangiogenesis and metastasis via activating FOXK1 transcription in triple-negative breast cancer[J]. J Hematol Oncol, 2020, 13: 17.[3] Kuscu Cem,Arslan Sevki,Singh Ritambhara et al. Genome-wide analysis reveals characteristics of off-target sites bound by the Cas9 endonuclease[J]. Nat. Biotechnol., 2014, 32: 677-83.[4] Tsui Chiahao, Inouye Carla, Levy Michaella et al. dCas9-targeted locus-specific protein isolation method identifies histone gene regulators[J]. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 2018, 115: E2734-E2741. 赞 (0) 相关推荐 CRISPR-Cas9基因敲除技术原理 这是一篇针对实验室萌新写的关于CRISPR-Cas9技术的详细介绍,对于实验室老手也建议收藏转发给师弟师妹,这样省心省力,又能节省大量讲解时间,这不香么? 原核生物的"免疫系统" ... 基因敲除细胞系快速高效的构建方法 一.CRISPR/Cas9系统的工作原理 CRISPR系统是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御机制,其中以二类CRISPR系统即CRISPR/Cas9最为经典常用.此系统的工作原理是 ... 基因编辑热点研究方向全面盘点,一文带你了解基因魔剪的前世今生 导语 2020年10 月 7 日,瑞典皇家科学院宣布,将诺贝尔化学奖授予法国埃马纽埃尔·卡彭蒂耶(Emmanuelle Charpentier)和美国詹妮弗·杜德纳(Jennifer A. Doudn ... 转录抑制技术原理 转录抑制概述 CRISPR/Cas9系统是一种由RNA引导Cas9蛋白对靶基因进行修饰的技术.将Cas9中两个核酸酶结构域突变,就会使Cas9蛋白失去对DNA的切割活性,但不影响其与DNA的结合能力, ... 基因敲除载体构建技术原理 CRISPR/Cas9简介 CRISPR/Cas9系统是近几年出现的一种由RNA指导Cas核酸酶对靶向基因进行特定DNA修饰的技术.在这一系统中,crRNA(CRISPR-derived RNA)通过 ... CRISPR/Cas9基因敲除技术是什么? CRISPR/Cas9系统由核酸酶Cas9和单链向导RNA (single guide RNA, sgRNA)组成.Cas9蛋白具有两个核酸酶结构域--RuvC样结构域和HNH结构域(RuvC结构域负 ... Molecular Cell:CRISPR技术给抗体诊断实验带来革命性的变化 科学家们利用基因组编辑技术CRISPR开发了一种新工具,可以在患者血液样本中识别SARS-CoV-2抗体. 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