抑制过度激活的TGFβ信号能够缓解小鼠体内异位骨化的进展 | 文献精读
摘要：
获得性异位骨化是一种令人痛苦和折磨人的疾病，该病的主要特点是外伤后骨外组织成骨。异位骨化的确切发病机制目前仍没有统一的定论。本研究发现TGFβ能够启动并促进小鼠的异位骨化。异位骨化开始后，钙化的软骨新形成的骨组织能够吸收破骨细胞，这导致了TGFβ的高水平表达，TGFβ在异位骨化微环境中能够招募间充质基质细胞/前体细胞（MSPC）。在跟腱转基因过表达TGFβ能够自发介导异位骨化的形成，然而在系统性注射TGFβ中和抗体后，创伤诱导的以及BMP介导的异位骨化小鼠模型以及纤维发育不良骨化进展小鼠模型的体内异位骨化被缓解了。而且，MSPC细胞中诱导敲除TGFβ2型受体抑制了异位骨化小鼠模型骨化的进展。我们的研究指出作为异位骨化的诱导者和推动者，TGFβ高水平高表达促进异位骨化，TGFβ可能成为未来异位骨化治疗的新的靶点。
异位骨化是一种骨外组织异常的成骨的一种疾病，该病严重损害病人的健康和影响病人的生活质量。异位骨化常常是获得性的，在极少数病人中可能是先天获得的。获得性异位骨化在临床上是创伤后常见的并发症，包括骨折，髋关节成形术后，深度烧伤以及中枢系统外伤后。然而，目前获得性异位骨化的发病机制仍然不清楚。临床治疗主要局限于放射，外科切除等，但是该病的复发率及其高（放疗后复发82-100%，外科切除后复发17-58%）。在以下罕见的遗传性疾病如纤维发育不良骨进展病（FOP）和进行性异位骨肥大（POH）等中也可见异位骨化的形成。纤维发育不良骨进展病主要是体内BMP1型受体R206H基因，以及激活素受体样激酶2（ALK2）基因的杂合突变所致。但是对该类疾病目前尚无有效的治疗方法。进行性异位骨肥大（POH）主要是GNAS基因杂合突变导致的膜内骨形成所致。
从组织学角度可以看到异位骨化和纤维发育不良骨进展病（FOP）都是软骨内成骨，主要包括四个过程，炎症，软骨形成，骨形成以及成熟。多种细胞在复杂的信号调解下参与该过程，包括组织间充质细胞，血管细胞，循环细胞，造血细胞以及骨髓来源的细胞。首先，在炎症阶段，免疫细胞在病点浸润。在纤维发育不良骨进展病（FOP）小鼠模型中发现上皮细胞ALK2的固有激活能够引起上皮间质转化从而获得干细胞表型。在软骨阶段，间充质基质细胞/前体细胞（MSPC）分化成软骨细胞。在骨形成阶段，软骨经过肥大，钙化，血管长入形成含有骨髓的骨小梁。
TGFβ家族包括TGFβ1，2，3.，主要在哺乳动物体内表达，参与组织重塑和损伤修复。很多疾病与TGFβ异常激活有关，如皮肤纤维化，肾脏，肝脏，肺等器官恶性肿瘤的转移。TGFβ信号在时间和空间的表达障碍也会引起一些并发症，包括马凡氏综合征和骨关节炎等。骨形成是伴有血管长入的过程，在异位骨化形成阶段可见异常丰富的血管。
我们课题组曾经发现在骨形成阶段，TRAP阳性破骨前体细胞分泌的PDGF-BB能够招募内皮前体细胞以及间充质基质细胞/前体细胞（MSPC），结合到CD31highEmcnhigh的血管上（H型血管）。在本研究中，我们发现高水平激活TGFβ能够增加间充质基质细胞/前体细胞（MSPC）的数量以及促进异位骨化的形成。包括获得性异位骨化和纤维发育不良骨进展病。PDGF-BB浓度也被增加在异位骨形成过程中。而抑制TGFβ能够在不同啮齿类动物模型中发现异位骨化得以缓解。
结果：
1. 在人类异位骨化病人中发现TGFβ的活性增高。
为了确定异位骨化的发病机制，实验首先检查了获得性异位骨化病人的样本，这些样本从肘关节骨折或者神经系统损伤的病人内固定术中获得。影像学确定获得的样本处于骨形成阶段（一般在外伤后3-4月）和成熟阶段（一般在外伤后14-16个月）。HE和番红快绿染色发现成骨阶段，骨小梁和骨髓附近的软骨层增厚。相反，在成熟阶段发现发育更好的骨小梁和骨髓结构，伴有更厚的蛋白聚糖丰富的软骨细胞（Figure. 1a, b，蛋白聚糖红色，异位骨绿色）。TRAP染色在骨形成节段TRAP阳性的破骨前体以及破骨细胞的数量也异常的丰富，然而在成熟阶段却降低 （Figure 1 c, d）。磷酸化的Smad2/3（TGFβ下游的信号分子）阳性的细胞在成骨阶段也高表达，而在成熟阶段表达降低（Figure 1 e pSmad2/3阳性细胞棕色, f，）。而且免疫染色发现PDGF-BB阳性的细胞的数量在成骨阶段也异常增加，在成熟阶段降低 (Figure 1g, PDGF-BB阳性的细胞棕色；h)。在异位骨形成病人成骨阶段发现病人血清TGFβ1和PDGF-BB的水平相对于成熟阶段也极大的提高，且在两个阶段，这两个指标均高于健康的对照组 （Figure 1i,j虚线表示健康人TGFβ和PDGF-BB平均浓度，TGFβ 1.23ng/ml; PDGF-BB1.68nl/ml）。人类间充质干细胞标记物CD73和CD90免疫染色在成骨阶段人类体内骨髓间充质干细胞的数量也极大增加，而在成熟阶段降低（Figure 1k, l；CD73阳性绿色；CD90阳性红色）。
综上，我们认为在获得性异位骨化病人中异位骨化是软骨内成骨过程。
2. 异位骨化小鼠模型骨化进展阶段骨重塑激活。
为了证明异位骨化骨形成节段的机制，我们使用了创伤诱导的异位骨化小鼠模型 （经皮跟腱穿刺，ATP）。在针刺后6S发现异位骨组织，继续生长至15周 （figure 2a；跟腱中间矢状位微CT，附件figure 1a）。HE和番红快绿染色以及2型胶原免疫染色实验发现在针刺后典型的软骨骨化（Figure 2b, 附件figure 1b,c）。丰富的蛋白聚糖进而2型胶原在针刺3周后出现，逐渐向异位骨化中心迁移，一直到软组织新形成骨的外层 （figure 2b，附件figure 1b,c）。针刺后6周出现未成熟的编织骨，在9-15周间可见含有骨髓的发育完成的骨小梁结构（figure 2b，附件figure 1b,c）。与人类异位骨化相似，TRAP染色发现TRAP染色阳性的细胞在针刺后6周增加，当15周破骨细胞持续吸收产生更大的骨髓腔的时候，TRAP阳性的出现了减少（Figure 2c, d）。磷酸化Smad2/3（TGFβ下游的信号分子）阳性的细胞在针刺三周后就出现了增加一直维持高水平，15周开始降低（Figure 2e,f）。PDGF-BB阳性细胞的数量在针刺三周后也出现了增加，第六周达到平台期，然后15周开始降低 （Figure 2g,h）.ELISA检测发现小鼠血清TGFβ1和PDGF-BB的水平也在针刺3周升高，第九周达到高峰，然后逐渐降低 （Figure 2i, j）。
在成年体内，Nestin阳性的细胞是间充质基质细胞/前体细胞（MSPC）的亚类，在内皮前体细胞增殖节段Nestin表达。研究发现Nestin阳性的血管与钙化骨有关。免疫染色发现，与对照组相比，Nestin阳性细胞在针刺异位骨化小鼠模型的异位骨骨髓中数量增加 （Figure 2k，Nestin阳性的细胞红色； l）。CD31和Emcn免疫染色揭示了在针刺3周软骨形成区域周围出现了CD31highEmcnhigh的血管（H血管），然而在外层区域血管类型为CD31-Emcn+的血管 ,软骨中不存在（Figure 2m, Emcn+ (绿色) and CD31+(红色) ）。H型血管在针刺6周后异位骨骨髓腔发现，数量远远高于对照组。（Figure 2m,n）,表明在H型血管形成特异性在骨形成阶段。且H型血管数量在15周后降低到基线水平，接近假手术组（Figure 2m,n）。在针刺6周后，骨钙蛋白阳性（OCN+）的成骨细胞出现参与骨形成，在15周开始降低（Figure 2 o, p）。
总之，针刺介导的异位骨化模型与人类异位骨化骨样本相似，提示高浓度的TGFβ激活可能导致了异位骨化的进展。
3. 异位骨化炎症阶段TGFβ信号增强。
炎症是异位骨化发展的始动环节。我们发现在针刺后4天出现CD68阳性的免疫细胞聚集和高水平的活性TGFβ （Figure 3a-d），表明激活的TGFβ在异位骨化开始阶段联系密切。有研究报道在巨噬细胞内炎性因子能够促进活性TGFβ的释放。为了弄清楚巨噬细胞在异位骨化中所扮演的角色，我们首先在集落刺激因子1缺陷（CSF-/-）小鼠分析异位骨化情况。该小鼠有巨噬细胞缺陷，因为CSF1是单核巨噬细胞系存活的必须因子。在针刺小鼠跟腱6周后发现异位骨化被抑制（Figure 3e,f）。我们进一步产生了LysM-cre::Tgfb1flox/flox小鼠模型（Tgfb1-/-）,该小鼠模型体内的免疫细胞包括单核巨噬细胞系和中性粒细胞都不再表达TGFβ1.。再一次，针刺小鼠跟腱6周后，在Tgfb1-/-小鼠体内未发现异位骨化的形成，然而在Tgfb1flox/flox对照小鼠体内却发现明显的异位骨化形成 （Figure 3g,h）
因此，是免疫细胞分泌的TGFβ启动了异位骨化的形成。
为了进一步探究高水平的活性TGFβ在异位骨化形成中的作用机制，我们使用了CED源TGFB1突变（H222D）的TGFβ转基因小鼠，在该小鼠体内，活性TGFβ的高表达由1型胶原启动子所驱动 （CED鼠）。针刺跟腱后，异位骨化自发形成，此时在4个月大的CED鼠能够发现丰富的1型胶原（18/22），然而野生鼠并未发现异位骨化 （Figure3i-k）。小鼠爪子的韧带中发现骨化，很可能由于在高水平活性TGFβ的刺激下，跟腱和爪子韧带都有丰富的1型胶原的表达，同时这两个部位承受更大的机械压力 （附件Figure 2）。Nestin阳性的细胞在CED鼠异位骨髓中的数量也高于对照的野生组 （figure 3l, m)。和预期一样，CD31highEmcnhigh的血管（H血管）在鼠异位骨髓中的数量也高于对照的野生组 （Figure 2n,o, 黄色）。骨钙蛋白阳性的成骨细胞也是相同的趋势变化 （Figure 3p,q）。
因此，CED鼠在跟腱针刺后能够产生ATP鼠相似的异位骨化模型，表明高水平的活性TGFβ是异位骨化进展的驱动力。
4. TGFβ抗体缓解ATP介导的异位骨化的进展。
我们接下来研究了是否如果抑制TGFβ活性能够缓解异位骨化。我们使用了TGFβ中和抗体（1D11;R/D）或负载抗体（相似的IGG复合物，但是缺乏TGFβ结合能力，13C4；R/D）。从建模开始一周三次（炎症阶段d1，软骨阶段w3，骨形成节段，w6 ）， 或成熟阶段（w12）两种抗体均在不同时间点注入ATP诱导的异位骨化鼠体内，。15周后处死小鼠。注射1d11的小鼠在d1,w3,w6组异位骨化相对于对照组均得到极大的缓解 （Figure4 a-c）。然而，在术后12周，注射1D11抗体并没有明显减少骨形成 （Figure4 a-c）。
为了揭示异位骨化形成过程中信号通路的改变，我们重复了实验，在ATP第9周取材。免疫染色发现在注射1D11小鼠体内的磷酸化Smad2/3相对于对照组（TGFβ下游的信号分子）明显减少 （d1,w3,w6） （Figure 4d,e）。TGFβ的浓度也是相似的趋势 （Figure4 f）。Nestin阳性的细胞，H血管，以及骨钙蛋白阳性细胞的数量均是相似的变化，在注射1D11组明显降低（d1,w3,w6）（Figure 4g,l）。微CT分析跟腱发现注射TGFβ中和抗体后并没有异位骨化形成 （附件figure 3）。
因此，这些结果表明，在炎症阶段，软骨阶段和成骨阶段抑制TGFβ信号活性能够缓解异位骨化的进展。
5. TGFβ抗体缓解BMP介导的异位骨化的进展。
增加的BMP信号活性是介导FOP病人和动物模型异位骨化的进展的因素。因此我们探究TGFβ抗体对于BMP介导异位骨化小鼠的治疗效应。BMP2/明胶架植入小鼠小腿三头肌内产生异位骨化（BMP2/明胶植入鼠模型， BGI）。植入两周后出现异位骨化，四周开始长大（附件figure 4a,b）。HE和番红快绿染色发现植入两周后钙化的软骨形成，四周后形成发育良好的含有骨髓的骨组织 （附件figure 4c,d），表明，在2周是软骨和成骨混合节段，四周是成熟阶段。Nestin阳性的细胞，磷酸化Smad2/3细胞，以及骨钙蛋白阳性细胞的数量在第二周均增加而在第四周降低到对照组水平（附件figure 4e-j）。
因此，TGFβ信号通路在BMP信号介导的异位骨化中也被激活。
我们进一步探究TGFβ是否在BGI小鼠体内直接参与异位骨化的进展。我们分别在d1,w2,w6 注射1D11，均持续两周，在第8周处死小鼠取材。小腿三头肌异位骨形成被植入BMP第一天注射的1D11阻断，相似的结果在W2时也发现了。然而，在第四周注射1D11和对照组相比，对异位骨化并没有明显的影响 （Figure 5a-c， 微CT和HE染色）。
为进一步研究细胞机制，BGI异位骨化小鼠分别在植入BMP后D1, W2注射1D11，均持续两周，在第四周处死小鼠取材。结果发现所有组的磷酸化的Smad2/3阳性细胞的数量都非常少 （figure 5d, e）。与ATO小鼠注射1D11后结果相似，和对照组相比，无论是D1还是 W2组，Nestin阳性细胞的数量在注射1D11小鼠体内明显降低 （Figure 5h-k）.
我们还分析了在经过空载体，1D11处理后从成骨阶段开始，ATP和BGI鼠的移动性，并和对照组相比。结果通过量化小鼠足迹模式，测量指标包括步幅长度和前后脚印重叠。结果发现和对照组相比，并没有明显差异 （附件Figure 5）。
我们还是用了FOP小鼠模型，在这种模型中，注射Adenovirus Cre (Ad.Cre)和眼镜蛇毒素因子后，ALK2被固有激活，我们发现注射1D11也极大的降低的异位骨化的进展 （Figure 5l,m）。
综上，无论是原发性还是获得性，TGFβ参与异位骨化的进展是一种常见的病理机制。
6. Nestin阳性的细胞参与异位骨化过程中血管生成。
为了进一步了解异位骨化中TGFβ活性增高诱导增加的细胞的角色，我们用Nestin-GFP转基因小鼠构建通过BGI方法构建异位骨化模型鼠，分析Nestin阳性细胞在异位骨化中的作用。在植入BGI4周后，通过流式细胞仪检测异位病变组织中的CD45-GFP+的Nestin细胞。85%的异位骨组织中Nestin 阳性的细胞出现瘦素受体（LepR公认的骨髓间充质细胞标记物）的共表达 （Figure 6a）。以往研究发现80%的GFP+LepR+细胞也表达Sca-1或CD105，这也是骨髓间充质细胞的标记物，然而仅仅2%的GFP+LepR+细胞表达CD31 （Figure 6b, 附件Figure 6）。相反，90%的GFP+LepR-细胞CD31阳性，SCa-1和 CD105阴性 （Figure 6c, 附件Figure 6）。茜素红染色和体外人工基底膜试验表明GFP+细胞参与骨形成 （Figure 6d）和血管形成 （Figure 6e），提示异位骨组织中Nestin阳性细胞参与骨形成和血管形成。
我们接下来产生了他莫西分介导的Nestin-creERT2::R26R-EYFP小鼠，分别在ATP后，3周和6周追踪Nestin阳性细胞在异位骨化过程中的迁移。在ATP三周后，90%以上的软骨细胞来源于Nestin阳性细胞系 （Figure 6 f,g）。CD31/YFP和Emcn/YFP的免疫共染色发现70-86%的H型血管在ATP6周后由Nestin阳性细胞系形成 （Figure 6 h,i）。已有实验发现跟腱源Scx阳性的细胞是FOP鼠模型的骨化细胞前体。为了检测跟腱Scx阳性细胞是否也是获得性异位骨化的主要来源细胞，我们使用了ATP鼠模型，我们通过Scx-creETR2小鼠与R26R-EYRP鼠杂交产生了他莫西分介导的Scx-creERT2::R26R-EYFP小鼠。仅仅不到2%的Scx阳性细胞参与软骨形成，不到5%参与血管形成。初步推测，在先天和获得性异位骨化中参与的主要细胞是不同的。
我们也进一步产生了TGFβ2受体介导的鼠敲除模型（Nestin-creERT2::TGFBR2FLOX/FLOX）。当Nestin-creERT2::TGFBR2FLOX/FLOX鼠经过ATP或BGI处理后，老鼠接受他莫西分注射每周三次，以达到特异性敲除Nestin阳性细胞的Tgfbr2 (Tgfbr2-/-)。有趣的是，无论是ATP还是，BGI在Tgfbr2-/-鼠中均未发现异位骨化形成，然而在Nestin-creERT2::TGFBR2FLOX/FLOX鼠中（注射空载体）却出现了明显的异位骨化（Figure 7a-f）。我们也是用了他莫西分处理的Nestin-creERT2鼠（Cre）作为对照，排除他莫西分本身的可能的异位成骨作用。他莫西分处理的Cre鼠和Tgfbr2-/-鼠并未发现明显的差异 （附件 Figure 8a-d）。而且，经过ATP或BGI处理后，Nestin阳性的细胞在Tgfbr2-/-鼠跟腱中均未发现（Figure7 g-j）。同样，跟腱活小腿三头肌的的H型血管在Tgfbr2-/-鼠明显减少 （Figure7 k-n）。
以上数据表明激活的TGFβ增加了Nestin阳性细胞的数量，而Nestin阳性细胞进一步参与血管形成。同时TGFβ驱动异位骨形成，抑制TGFβ能够缓解异位骨化进展。
参考文献：
1 Wang X, Li F, Xie L et al. Inhibition of overactive TGF-beta attenuates progression of heterotopic ossification in mice. Nat Commun 2018; 9:551
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