国自思路：糖酵解基因、TLR、免疫调控、自身免疫疾病
2021年度国自然医学部国自热点的中标数统计如下：
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2022热点 |
2021年医学部总中标数 |
2022热点 |
2021年医学部总中标数 |
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免疫调控 |
852 |
乙酰化 |
135 |
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血管生成、重构 |
531 |
细胞焦亡 |
118 |
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线粒体 |
485 |
代谢重编程 |
118 |
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外泌体 |
430 |
单细胞测序 |
105 |
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miRNA |
413 |
组蛋白修饰 |
19 |
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干细胞 |
371 |
内质网 |
76 |
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lncRNA |
371 |
炎性小体 |
76 |
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细胞自噬 |
358 |
中性粒细胞诱捕网 |
67 |
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肠道菌群 |
312 |
糖酵解 |
13 |
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circRNA |
287 |
氧化应激 |
11 |
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m6A、m5C、m7G |
270 |
类器官 |
46 |
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铁死亡 |
257 |
超级增强子 |
25 |
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转录调控 |
232 |
相分离 |
21 |
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缺氧、低氧 |
211 |
乳酸化修饰 |
21 |
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泛素化 |
186 |
迁移体 |
4 |
免疫调节指机体通过免疫系统识别和排除抗原性异物，维持自身生理动态平衡与相对稳定的生理功能的过程。免疫系统——由免疫器官（胸腺、骨髓、脾、淋巴结、扁桃体等）、免疫细胞（淋巴细胞和吞噬细胞等）和免疫活性物质（体液中各种抗体、淋巴因子、溶菌酶等）构成。免疫应答——当机体受抗原刺激后，免疫细胞识别抗原并发生活化、增殖、分化，并显示一系列生物学效应，这个过程被称为免疫应答，主要包括固有免疫应答和适应性免疫应答。“自身免疫性疾病”——是免疫疾病的一种，是免疫系统对自身机体的成份发生免疫反应，造成损害而引发疾病。
免疫细胞代谢重编程与免疫应答。在生命体中，免疫系统持续地感知和应答环境的威胁，是一个消耗能量的过程。免疫细胞不能储存营养物质，只能从外界环境摄取大量葡萄糖、氨基酸和脂肪酸，以维持自身免疫应答。免疫细胞摄入营养物质活动增强，一是为活化的免疫细胞提供合成ATP的底物，维持免疫细胞的活动；二是提供免疫细胞增殖和活化合成大分子（RNA，DNA，蛋白质和细胞膜）的原材料。因此，为了应答细胞外的刺激，免疫细胞成熟的关键步骤是对细胞的代谢重编程。不同的代谢模式影响不同免疫细胞亚群的分化；如活化的中性粒细胞、M1巨噬细胞、iNOS表达的树突状细胞（DC）主要依靠糖酵解提供能量；调节性T细胞（Treg）、M2巨噬细胞主要依靠脂肪酸氧化（FAO）产生的氧化磷酸化来提供能量。
Toll样受体(Toll-like receptors, TLR)是参与非特异性免疫(天然免疫)的一类重要蛋白质分子，监视与识别疾病相关分子模式(PAMP),是连接非特异性免疫和特异性免疫的桥梁,机体抵抗感染性疾病的第一道屏障。TLR在调节导致炎症和自身免疫性疾病发病机制的免疫细胞异常激活方面发挥着关键作用。丙酮酸激酶M2（PKM2）控制着糖酵解的最后一步，涉及多种细胞过程和病理状况。但是，关于PKM2参与调控TLR介导的炎症和自身免疫的了解甚少。
2021年4月22日发表在Frontiers inImmunology上题为“Pyruvate Kinase M2 Contributes toTLR-Mediated Inflammation and Autoimmunity by Promoting Pyk2 Activation”的文章，研究了丙酮酸激酶M2通过促进Pyk2活化来促进TLR介导的炎症和自身免疫的机制。
1. TLR4/TLR7/TLR9 通路的激活诱导 PKM2 表达的上调
TLR4 激动剂 LPS、TLR7激动剂 R848 和 TLR9 激动剂 CpG-1826 在 BMDMs（图1A）、BMDCs（图 1B）和 B 细胞（图 1C）中以时间依赖性方式显著促进 PKM2 mRNA 表达；蛋白质水平上也观察到了相同的现象（图 1D）。LPS 攻击的小鼠在肝脏和肺组织中显示出更高水平的 PKM2 表达（图 1E）。LPS激动剂咪喹莫特（imiquimod）处理小鼠脾脏中 PKM2 的表达显著增加（图 1F）。此外，自发性狼疮 MRL/lpr 小鼠脾脏中的 PKM2 表达也异常升高（图 1F）。上述研究表明，在体内和体外条件下，TLR通路的激活诱导了PKM2的表达。
图1
2. PKM2 在体外条件下增强巨噬细胞中 TLR4/TLR7/TLR9 通路的激活
PKM2 通过转染 PKM2-LV 在 BMDM 中的过度表达显著促进了 LPS-、R848-和 CpG-1826 诱导的CD86（图 2A）和 CD40（图 2B）的表达。此外，在LPS、R848或CpG-1826（图2C）影响下分泌的IL-12和TNF-α水平在转染PKM2-LV的BMDM中高于用NC-LV转染的BMDM中的水平。PKM2过表达显著促进了 LPS、R848 或 CpG-1826 诱导的 p38、Erk、JNK 和 p65 的磷酸化（图 2D）。BMDM 中的 抑制PKM2表达显著降低了LPS-、R848-和 CpG-1826 诱导的 CD86（图 2E）和 CD40（图 2F）的表达，以及 IL-12 和TNF-α 的分泌（图 2G)。PKM2 敲低显著抑制了 LPS、R848 或 CpG-1826诱导的 p38、Erk、JNK 和 p65 磷酸化（图 2H）。所有这些数据表明， PKM2 增强了 TLR4/TLR7/TLR9 通路的激活。
图2
3. PKM2的药理学抑制降低了BMDM、BMDC和B细胞中TLR4/TLR7/TLR9通路的激活
PKM2 抑制剂 PKM2-IN在浓度低于 80 µM 时不影响 BMDMs 和BMDCs 的活力，当浓度低于 16 µM 时不影响 B 细胞的活力。PKM2-IN 预处理在 BMDM 中以剂量依赖性方式显著降低了 LPS、R848 和 CpG-1826诱导的 CD86 和 CD40 表达（图 3A）。在 BMDC（图 3B）和 B 细胞（图 3C）中也发现了类似的现象。同样，PKM2-IN 以浓度依赖性方式显著抑制 LPS、R848 和 CpG-1826诱导的 BMDM 和 BMDC 分泌的 IL-12 和 TNF-α（图 3D、E）。Q-PCR 在 B 细胞中也观察到相同的现象（图3F）。可以得出结论，PKM2的阻断显著抑制了TLR4/TLR7/TLR9诱导的BMDM、BMDC和B 细胞的激活。
图3
4. PKM2的药理学抑制抑制了TLR4/TLR7/TLR9介导的MAPK和NF-κB通路的激活
PKM2-IN 以浓度依赖性方式显著抑制 LPS、R848 和 CpG-1826 诱导的BMDM 中 p38、Erk、JNK 和 p65 的磷酸化（图4A）。此外，PKM2-IN 还以浓度依赖性方式显著抑制 BMDC 和 B 细胞中 p38、Erk、JNK 和 p65 的磷酸化（图 4B、C）。这些数据表明，PKM2减轻了BMDM、BMDC和B细胞中TLR4/TLR7/TLR9通路的激活。
图4
5. Pyk2 参与 PKM2 对TLR4/TLR7/TLR9 通路激活的促进作用
TLR4/TLR7/TLR9 通路的激活诱导了Pyk2的磷酸化，而PKM2-IN的添加逆转了BMDM、BMDC和 B 细胞中 TLR4/TLR7/TLR9 诱导的 Pyk2 磷酸化（图 5A-C）。Pyk2 抑制剂 TAE226 显著抑制TLR4/TLR7/TLR9 诱导的 BMDM 上 CD86 和 CD40 的表达（图 5D、E），并减少了 TLR4/TLR7/TLR9 通路诱导的 IL-12 和 TNF-α 的分泌（图5F），以及 IL-12 和 TNF-α 的 mRNA 水平。Co-IP结果表明PKM2 不与 Pyk2 结合（图 5G）。所有这些数据表明，Pyk2 和 ERK 参与了 PKM2对 TLR4/TLR7/TLR9 通路激活的促进功能。
图5
6. PKM2 的药理抑制减轻了 LPS诱导的内毒素休克
PKM2-IN腹腔注射显著降低LPS攻击小鼠的死亡率；PKM2-IN注射剂量越大，在一定剂量范围内小鼠的存活率越高（图6A）。使用 PKM2-IN 给药的内毒素休克小鼠显示 IL-12 和 TNF-α 的血清水平显著降低（图 6B）。H&E 染色显示 PKM2-IN 显著减轻 LPS 诱导的肝和肺损伤（图 6C）。此外，TUNEL 染色显示PKM2-IN 处理的内毒素休克小鼠显著降低了肺组织和肝组织的凋亡细胞百分比（图 6C）。PKM2-IN 显著降低了脾巨噬细胞和 DC 上 CD86 和 CD40 的表达（图 6D-G）。
图6
7. PKM2 的药物抑制可缓解 TLR7 配体 IMQ 诱导的狼疮模型
PKM2-IN 的治疗效果旨在研究小鼠的狼疮症状（图7A）。在一定条件下全身治疗后，咪喹莫特显著诱导小鼠脾肿大，然而在 PKM2-IN 处理的 IMQ 小鼠中显著逆转（图 7B、C）。PKM2-IN 处理的 IMQ 小鼠表现出抗 dsDNA 抗体的减少（图7D），H&E 染色表明小鼠肾脏中淋巴样细胞浸润的显著抑制以及系膜基质的扩散扩张（图7E ），免疫荧光染色显示小鼠中 IgG（图 7F）和 IgM（图 7G）的肾小球沉积量相对较少。PKM2-IN 处理显著逆转了 IMQ 诱导的 CD86 和 CD40在脾巨噬细胞（图 7H）、DC（图 7I）和 B 细胞（图 7J）上的表达。然而，PKM2-IN 处理显著降低了 IMQ 小鼠脾脏中 GC B 细胞和 Tfh 细胞的百分比。这些结果表明，PKM2活性的阻断缓解了IMQ小鼠的症状。
图7
8. PKM2 的药物抑制可缓解 MRL/lpr 小鼠的狼疮症状
与 C57BL/6 小鼠相比，媒介物处理的 MRL/lpr 小鼠表现出明显的脾肿大，而 PKM2-IN 处理的 MRL/lpr 小鼠显著逆转了该情况（图 8A、B）。PKM2-IN 处理的 MRL/lpr 小鼠中抗 dsDNA 抗体的血清水平低于空载处理的 MRL/lpr 小鼠（图8C）；H&E 染色显示小鼠肾脏中淋巴样细胞的浸润以及系膜基质的弥漫性扩张有显著的抑制 (图 8D)；免疫荧光染色显示小鼠中 IgG（图 8E）和 IgM（图 8F）的肾小球沉积量减少。CD86 和CD40 在空载处理的 MRL/lpr 小鼠的脾巨噬细胞、DC 和 B 细胞中的表达均显著高于未处理小鼠。此外，PKM2-IN 处理显著逆转了 MRL/lpr 小鼠巨噬细胞（图 8G ）、DC（图 8H）和 B 细胞（图8I）中 CD86 和CD40 的异常表达。因此，阻断PKM2的活性减轻了MRL/lpr小鼠的状况。
图8
9. PKM2 在 SLE 患者中过度表达并与单核细胞、DC 和 B 细胞的激活相关
PKM2-IN 显著抑制 LPS、R848或 CpG-2006S 诱导的 CD86 和 CD40 在人MDMs（图 9A、B）和 B 细胞（图 9C、D）中的表达。与健康供体相比，SLE 患者的 CD14 单核细胞（图 9E）、CD11c DC（图 9F）和 CD19 B 细胞（图 9G）中PKM2 的表达显著增加。PKM2 的表达水平与单核细胞（图9H、I）、DC（图 9J、K）和 B 细胞（图 9L、M）中的活化标志物 CD86 和 CD40 显著正相关。这些数据表明，与健康供体相比，SLE患者的单核细胞、DC和B细胞中的PKM2表达高度升高。此外，PKM2表达水平与这些免疫细胞的激活程度呈正相关，表明PKM2在促进 SLE患者免疫细胞的激活方面发挥了关键作用。
图9
总之，这些结果证实了作者的假设，即 TLR 的过度激活可导致 PKM2过表达，而 PKM2 通过促进 Pyk2 激活来增强 TLR4/TLR7/TLR9 诱导的巨噬细胞、DC 和 B 细胞的激活，从而促进TLRs 介导的炎症和自身免疫的发病机制。PKM2-IN 对 PKM2 的药物抑制可以抑制 TLR4/TLR7/TLR9 诱导的巨噬细胞、DC 和 B 细胞的激活，并减轻 TLR 介导的炎症和自身免疫的发病机制（图 10）。这些发现可能有助于更好地理解炎症和自身免疫的发病机制，并为控制 TLR 相关疾病提供一个潜在的靶点。
分子机制图