术中冰冻制片切片与染色操作要点知识清单
组织冷冻、切片、固定与染色是术中冰冻制片的关键技术环节。因为组织冰晶形成是一个不可逆的过程，所以组织冷冻是冰冻切片质量最重要的保证。在组织冷冻流程正确的前提下，优质的试剂、规范的切片染色流程、具备良好操作技能的技术员，都是做出优质冰冻切片的关键条件。
直播课程过后，将有关冰冻制片切片染色操作要点与技巧列个清单，方便小伙伴们实践操作查询。
冰冻制片切片染色操作要点与技巧知识清单
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组织冷冻的最佳温度与冰冻切片的最佳温度不是一个概念。组织冷冻的温度与冷冻方式决定了组织内冰晶形成的方式与数量，决定了冰冻切片中组织与细胞的形态结构是否正常。冰冻切片的最佳温度则是让组织维持较适宜的硬度，利于切出平整的冰冻切片。
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常规组织（非脂肪组织或脂肪含量低），最佳切片温度一般维持在-16℃~-20℃之间 。脂肪组织凝固温度低，则需要将切片温度调低至-35℃以下，切片厚度适当调厚至8~15微米并配合防卷板的使用，才能将脂肪组织较好切出。可以先做个印片后再做冰冻切片，冰冻片切不出来，还有张印片给医生做诊断。
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淋巴结取材需要尽量将外周的脂肪组织剔除干净，在淋巴结最优切片温度下，脂肪组织不凝固，切片时淋巴结切片不能与包埋剂黏连，不能良好展片，导致切片严重重叠与皱褶，甚至制片失败。
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冰冻切片机速冻台温度是组织冷冻的温度，而箱体温度与组织夹头的温度对切片温度影响较大，故冰冻切片机的温度设置推荐：速冻台温度宜低于-30℃，箱体与组织夹头温度设置在-16℃~-20℃。
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组织温度过低，切片时组织会碎裂，可以适当进行组织升温，至适宜的切片温度再切。
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组织升温的方式宜采用缓和的整体升温方式，如将组织拿出箱体，在室温中放置片刻令其温度升高。严禁在切片的过程中用手“捂”组织进行升温，手“捂”组织引起组织冻融后二次凝结，引起组织细胞细微结构的破坏，增加病理诊断风险。
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冷冻锤冷冻组织，组织越深冰晶的范围越大，建议冰冻切片粗修深度不宜超过600微米（粗修厚度30微米，修片不超过20次）。冰冻切片不一定要修到“最大切面”，粗修至满足诊断需要的“有效切面”即可，为后续的冰对常规制片保留更多病变组织。“少修”，对于病灶微小的冰冻组织尤其重要。
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冰冻切片适宜厚度在5~6微米（新鲜小淋巴细胞直径5~8微米）。
淋巴结冰冻切片：6微米，淋巴细胞厚薄适中，细微结构清晰。
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影响冰冻切片的平整度的因素还有切片刀架的角度、刀座刀架的稳固度、组织夹头的稳固度等。
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冰冻切片贴片后立即固定。贴片后组织切片的水分会快速蒸发，导致组织成分的“坍塌”，会严重破坏组织与细胞形态结构并导致颜色不良，增加了冰冻诊断的难度和风险。
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冰冻固定液，以AFA或Bouin’s固定液等含酸的固定液固定效果与染色效果好。单纯脱水型固定液对部分组织成分固定效果不良，例如甲状腺胶质，使用脱水型固定液固定，水洗后胶质成分会溶解消失。不同的固定液对染色效果会有较大影响，不同的试剂，最优操作流程是不一样的。
甲状腺癌冰冻切片：使用含酸复合型固定液，肿瘤胶质得以良好保存。
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使用含酸型冰冻固定液，固定后需将固定液洗净，避免固定液残留影响苏木素着色效果。
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冰冻切片HE染色，组织对苏木素伊红染色液的着色能力较强，在染色时间上会短于常规石蜡切片HE染色。因新鲜组织细胞核对苏木素的着色力较强，使用优质的苏木素染色液染色，控制染色时间，可以省略分化步骤。
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影响冰冻切片HE染色效果的因素：
(1) 试剂的品质；
(2) 适宜的染色流程；
(3) 技术员对染色原理的掌握程度；
(4) 技术员的实践经验及对切片质控的掌握程度。
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