【衡道丨干货】免疫组化实验中手工操作失误导致的不良结果与相应对策

本文编辑整理素材来源于中国现代医药杂志

免疫组织化学技术（Immunohistochemistry）是由免疫学和传统组织化学相互结合发展而来的一类实验技术，其是利用抗原（antigen）和抗体（antibody）间特异结合的原理，对组织片或细胞标本中的某些多肽和蛋白质等大分子物质进行原位的定性、定位或定量研究的技术，简称免疫组化。

随着免疫学、免疫化学和组织化学的不断发展进步，以及显微镜的更新进步，免疫组化技术也取得了长足发展，越来越多地渗透到医学及生命科学的各个领域。免疫组化种类很多，按照标记物的不同分类，可分为免疫荧光技术、免疫酶组织化学技术、免疫胶体金组织化学技术、亲和免疫组织化学技术四类，最常用的是亲和免疫组织化学技术。

因各类技术基本原理相同，使得不同类实验步骤大致相近，但因每一类技术的独特性，其操作步骤本身又都具有其特定性。免疫组化实验步骤繁琐，从取材、固定、组织处理、制片到抗原修复、染色步骤繁多，涉及的试剂至少十种，周期长，而且每个环节环环相扣，看似简单的实验操作，却往往不能得到理想的实验结果。

可以说，免疫组化实验看似简单，但在实际操作过程中出现的失败无不出自于细节的失误。本文将对免疫组化技术操作中出现的一系列操作失误及所造成的不良后果进行总结概括，并提出对应对策，以期为大家作参考学习。

1.

 组织固定不规范

①固定不及时，标本离体 30min 内未及时放入固定液中，或将固定标本放置在较高的温度环境中，导致蛋白的弥散或降解；

②固定不充分，或者因为标本过大，超过固定液的渗透能力，或者因为固定液过少，固定期间又未更换固定液，导致标本组织自溶；

③固定不完好，保存温度过高或选择了不合适的固定液，结果难以出现阳性表达。

对策

标本离体后30min内剖开固定，固定液以4%中性甲醛为宜，小标本固定时间4-6h，大标本18-24h或更久。

2.

切片不合格

①切片太厚，超过4μm，或厚薄不均导致脱蜡不充分，透明不彻底，光镜下出现组织上有白色云斑；

②捞片皱褶或边缘卷曲，造成抗体、染色液清洗不干净，出现假阳性或边缘效应，如图1所示；

图1 切片皱褶处及边缘非特异性着色

③选择不合适的载玻片，导致组织脱片现象发生；

④操作时不清洁，或使用污染的载玻片或捞片展片时展片箱内不清洁，封片时污染盖玻片，均出现光镜观察视野中杂物影，遮挡需要观察的组织细胞。

对策

严格切片质量把关，厚度3-4μm，无缺损、无皱褶、无折叠、无气泡，及时清洁展片箱。

3.

抗原修复不良

选择修复方式不正确，或修复不充分，或本无需修复的抗原误修复，导致组织脱片或结果阴性。

对策

严格按照抗体使用说明书进行修复，应根据抗体种类予以选择，要清楚影响抗原的因素及各种抗原修复方法，必要时可以多种方法同时使用。

4.

洗涤操作有误

①配合震荡仪的洗涤过程粗暴、频 繁、长时间洗涤导致组织脱片或组织破碎，出现非特异性着色，如图 2 所示；

图2：切片组织破碎，折叠造成的非特异性着色

②太慢则出现洗涤不充分，导致非特异性染色的出现。

对策

震荡仪转数控制在 80-90r/min最为适宜。

5.

抗体误用

①抗体不正确的保存，导致抗体效价降低，浪费经费，长期不用的抗体分装后存于-80℃，或加入等体积的甘油后放入-20℃冰箱保存，防止结冰，有效期长达数年。盛有抗体的容器也要密封好，必要时蜡膜封口，短期内频繁使用的抗体在 4℃保存数周，无需低温保存，以免反复冻融使效价降低，对于稀释过的抗体最好 1 周内用完，不宜长期保存使用。

②一抗稀释浓度不适宜，过高出现背景染色较深，或出现边缘效应，浓度过低阳性反应少或假阴性，或者因为一抗孵育时间过长或温度过高，出现染色背景较深，如图 3 所示。

图3：非特异性背景着色

③不规范的操作，一抗/二抗孵育过长，内源性过氧化物酶封闭时间不够，出现非特异性着色，如图 4 所示；或者抗体未完全覆盖组织出现边缘效应或花斑着色，如图 5、6 所示。

图4：腺体上皮及淋巴细胞非特异性着色

图5：抗体未完全覆盖组织造成的边缘效应

图6 抗体覆盖不均导致花斑着色

对策

应详细遵照抗体的说明书要求保存和使用，选择适宜的抗体稀释度，即摸索出阳性很清楚而背景也很好的最低抗体浓度，但应注意 “前带效应”，即抗原抗体结合时，其两者的比例对反应的结果有影响，若抗体分子过多，阳性反应反而减弱甚至呈现假阴性；为了降低背景可以用含有 BSA 的磷酸盐缓冲液作为抗体稀释液。

为了最大限度降低组织非特异性着色，缩短一抗/二抗孵育时间、稀释抗体浓度是很重要的，还需要通过延长灭活时间和增加灭活剂的浓度来降低因内源性过氧化物酶和生物素含量高带来的非特异性着色。

6.

复染选择不当

影响阳性反应的观察。

对策

阳性反应于细胞浆内时，可用苏木精、甲基绿等对细胞核进行复染；阳性表达在细胞核内时，应使用伊红对细胞质进行复染。目的是衬托出组织形态结构，利于细胞的观察，但不应影响阳性反应的观察。

小  结

免疫组化技术操作看似简单，但因人为及环境因素的干扰，结果未必尽如人意。需要每一位实验操作人员透彻了解实验原理，以高度的责任心规范进行每一步操作；值得提醒的是，实验者应在实验前充分查阅资料，做到心中有数，才能得到理想中的结果。

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