CAR-T疗法如何“更牛”？解决4大障碍是关键 | Nature深度好文
系列：深度综述——CAR-T疗法
杂志：Nature Reviews Clinical Oncology
亮点：
1）CAR-T细胞疗法是有史以来最有前途的抗癌疗法之一
2）美国NIH、科罗拉多儿童医院的两位科学家发表了一篇深度综述，全面剖析了导致CAR-T疗法“疗效不不持久”、复发和耐性性背后的四大关键阻碍，内容丰实、全面，强烈推荐
2012年4月，继CD19-CAR-T疗法治疗成人滤泡性淋巴瘤或慢性淋巴细胞白血病（CLL）首次取得成功后，第一例急性淋巴细胞白血病(ALL)患儿也被回输了CD19-CAR-T细胞。尽管出现了危及生命的毒性作用——细胞因子释放综合征（CRS），但这名患儿病情的显著恢复和持续缓解（目前已持续＞6年），以及其他儿童和成人患者同时出现的反应首次证实了，CAR-T疗法在治疗血液学肿瘤方面可诱导持久缓解。
之后，用CD19-CAR-T疗法治疗复发和/或难治性表达CD19 的B细胞恶性肿瘤的早期临床试验取得了前所未有的成功，许多患者实现了长期缓解，可能已被治愈。基于此，美国FDA于2017年批准了2款CD19-CAR-T疗法（Kymriah和Yescarta）上市，用于治疗B细胞ALL以及弥漫性大B细胞淋巴瘤。这类新型免疫疗法的获批革新了抗癌治疗。
目前全球范围内正在进行的>100项CAR-T疗法临床试验表明，除CD19外，靶向其它抗原（如BCMA）的CAR-T细胞也能够诱导类似的高缓解率。
不过，随着越来越多的患者接受治疗以及更长期的随访数据不断披露，科学家们意识到，约30-50%接受CD19-CAR-T疗法治疗后获得缓解的患者病情会再次复发，且复发大多数发生在接受治疗后1年内。这种现象并不是靶向CD19的CAR-T疗法所“独有”的。针对其它靶点（如CD22）的CAR-T疗法的初步临床试验表明，复发是一个常见的挑战。
另一方面，约10-20%的患者在接受CD19-CAR-T疗法治疗后未能获得缓解。靶抗原缺失或调变、CAR-T细胞在体内缺乏持久性以及产品生产失败是导致CAR-T疗法治疗“无效”的几大常见障碍。
随着CAR-T疗法的应用越来越广泛，了解并克服阻碍CAR-T疗法有效治疗的障碍将对更加充分利用这类疗法的抗癌潜能至关重要。
简单来说，CAR-T疗法是指，从患者体内分离出T细胞，然后在体外对T细胞进行改造，使其表达能够识别癌细胞的CAR，接着将这类CAR-T细胞进行扩增，最后回输到患者体内，发挥抗癌作用。（图片来源：Nature Reviews Clinical Oncology）
近日，来自美国NIH以及科罗拉多儿童医院的两位科学家在Nature Reviews Clinical Oncology发表了一篇深度综述[1]，对阻碍CAR-T细胞疗法在患者中产生持久缓解作用的因素进行了讨论，重点关注了导致疾病复发的耐药性机制；同时，文章还提出了克服这些障碍的潜在策略，并总结了CAR-T疗法可能覆盖的一些新适应症。
障碍一：未能达到缓解
CAR-T治疗想要成功，需要很多条件，包括患者符合接受CAR-T治疗的标准、CAR-T细胞产品能被成功生产出来并回输到患者体内、CAR-T细胞在体内能够有效介导细胞毒性反应；而对某些患者来说，这些条件就是障碍。
CAR-T细胞生产
由于CAR-T治疗的大多数癌症是侵袭性的，因此，CAR-T细胞的及时生产和回输仍然是实施有效CAR-T细胞治疗的障碍。这一过程的第一道障碍是T细胞的收集。不过，未能满足T细胞采集的ALL患者的占比具体是多大并不清楚。而即使T细胞收集成功，患者也可能无法接受治疗，比如CAR-T细胞生产失败。
在1项I期临床研究中，科学家们分析了接受CD19-CAR-T疗法治疗的儿童候选患者（paediatric candidates）的基线绝对淋巴细胞计数（absolute lymphocyte counts，ALCs），结果显示，中位ALC为1,228 cells/μl。这一发现表明，ALCs在正常生理范围内的患者“更容易”被选择接受CD19-CAR-T疗法治疗。
不过， CAR-T细胞生产技术的改进，可能会降低T细胞采集的限制。NCI的经验表明，CD3+细胞数量≥150 cells/μl就能够实现CAR-T细胞产品的生产。具体来说，在NCI开展的一项临床试验中，CD22-CAR-T细胞产品被成功生产，用于治疗55名患者；这些患者的中位CD3+细胞计数为567 cells/μl（范围为145–2,144 cells/μl）、中位ALC为775 cells/μl (范围为230–4,620 cells/μl)。
除了细胞数量，很多其它因素也与CAR-T细胞能否成功生产以及CAR-T产品质量密切相关。举例来说，有研究表明，患者先前接受的化疗方案（如那些含有氯法拉滨或阿霉素的化疗方案）已经被证实与产生数量不足或质量较差的CAR-T细胞产品有关。
此外，值得一提是，过去两年发表的研究结果显示，从高风险实体肿瘤患者身上分离出T细胞来制造CAR-T细胞产品可能尤其具有挑战性。这一现象背后的原因仍在调查。一种可能的解释是，与血液学恶性肿瘤患者相比，实体肿瘤患者体内循环骨髓源性抑制细胞（MDSCs，能够抑制T细胞生长）的数量更多。
CAR-T细胞生产过程的其它细节也可能影响最终的产品，从而影响随后的临床响应。目前，CAR-T细胞产品的生产方案包括一个T细胞扩增步骤，该步骤通常是通过激活T细胞受体（TCR）诱导的。基于CD3/CD28免疫磁珠[2]的扩增protocols，以及基于CD3抗体的扩增protocols都被用于生产被FDA批准的CD19-CAR-T产品。
大多数正在进行的临床试验protocols也使用了其中一种途径用于CAR-T细胞扩增。目前还没有关于哪种方法更好的定论。CAR-T细胞的扩增protocols通常还包括使用细胞因子，如IL-2、IL-7和/或IL-15。这些细胞因子的不同效应可能会影响最终CAR-T细胞产品的质量。
几乎所有CAR-T细胞产品都是由CD4+T细胞和CD8+T细胞共同产生的，但CD4+T细胞与CD8+T细胞的比值在不同患者之间可能存在很大差异，也可能影响CAR-T细胞产品。基于临床前研究数据，一些临床试验使用了由特定比例的CD4+T细胞和CD8+T细胞组成的CAR-T产品（如lisocabtagene maraleucel）。
即使CAR-T细胞产品能够成功生产，起始T细胞表型已被证明是后续临床活性的一个重要决定因素。在生产前选择特定表型的T细胞（如中央记忆T细胞或干细胞样记忆T细胞），或操纵生产条件使CAR-T细胞生产倾向于特别的T细胞群，可能会提高生产成功产品的可能性。很多团队正在开发能够优先生产某种特殊T细胞群的方法。
CAR的结构设计是可能影响CAR-T细胞产品特性以及“体内行为”（包括扩增动力学以及可在体内存在的时间）的另一个参数。目前临床试验中测试的CAR-T产品大多数是属于二代产品，它们包含一个TCR刺激域（通常源于T细胞表面糖蛋白CD3ζ链）以及单个共刺激域（如CD28 或4-1BB）。尽管临床前数据以及对患者的观察表明，这种CAR设计显著影响CAT-T产品的持久性，但共刺激域对响应率的影响尚未得到系统评估。
综述指出，利用来自健康捐赠者的细胞来生产CAR-T细胞产品是一种可以避免生产质量较差的CAR-T细胞的策略。一些早期研究证明了这种方法的可行性。不过这类产品可能需要额外的基因修饰来限制CAR-T细胞排斥反应和/或移植物抗宿主病。
CAR-T细胞回输
显然，在患者疾病进展或出现与疾病相关的并发症之前未能及时回输CAR-T细胞产品也可能妨碍治疗的成功。由于20-30%的候选患者最终并未能被注入CAR-T细胞，因此，未来仍需在缩短生产时间方面做出努力，从而增加能够受益于CAR-T细胞治疗的患者数量。
CAR-T 细胞激活和扩增
临床研究显示，尽管回输后CAR-T细胞的激活和指数扩增至关重要，但实现有效治疗所需的CAR-T细胞剂量其实非常小。目前的剂量方案是0.2–5.0×106 CAR-T 细胞/kg 或每次回输0.1–2.5 × 108 CAR-T 细胞。如前文所述，CAR-T细胞产品的质量以及固有的T细胞表型会影响回输后CAR-T细胞的行为。此外，与受体相关的因素、淋巴细胞耗竭（lymphodepletion，由化疗所致）对CAR-T细胞的扩增也非常重要。
CAR-T细胞疗法的可及性
尽管美国FDA已批准了2款CAR-T产品，但这种新疗法的可及性并不好。这也是CAR-T治疗领域目前需要重点解决的问题之一。
障碍二：复发
在接受抗CD19或抗CD22 CAR-T细胞治疗后，多达50%的pre-B细胞ALL患者在回输12个月后会以两种主要的模式复发：1）抗原阳性白血病的早期复发或2）典型的与抗原丢失相关的晚期复发（图1）。进一步了解CAR-T细胞持久性和/或耐受性差背后的机制，并鉴定出复发可能性高的患者对优化CAR-T细胞治疗至关重要。
图1 CAR-T疗法诱导持久缓解的限制因素（图片来源：Nature Reviews Clinical Oncology）
抗原阳性复发
早期ALL复发通常发生在成功诱导缓解后的最初几个月内，主要与CAR-T细胞持久性有限和/或短暂的B细胞再生障碍有关。CAR-T细胞持久性的决定性因素仍有待确定，除了固有的T细胞质量以及最初的T细胞表型（包括CD4 +T细胞和CD8+T细胞的比例），还包括CAR结构中的共刺激域。
临床前研究和临床试验数据表明，包含CD28共刺激域的CAR-T细胞的持久性逊于包含4-1BB共刺激域的CAR-T细胞。Kymriah的一项关键临床试验显示，基于4-1BB的CAR-T细胞在血液中可持续存在中位168天。相比之下，基于CD28的CAR-T细胞的中位持续时间为~30天，这些细胞在3个月以后很少被检测到。一些用于CAR结构设计的其它共刺激域和联合共刺激域（不止1个）将可能影响CAR-T细胞的持久性。
此外，一些研究表明，将CAR序列整合到特殊的基因（如TET2[3]、TRAC[4]）中也有助增强CAR-T细胞的持久性或抗肿瘤效应。基因编辑技术的进步将对这方面的研究发挥帮助。
一些临床试验也在尝试不依赖于CAR-T细胞设计和生产的、用于改善持久性的方法，例如，给患者注入T细胞抗原递呈细胞（T-APCs） 。这类细胞被设计用于在缓解后定期激活CD19-CAR-T细胞。将CAR-T细胞转化为中央记忆或干细胞样记忆表型是增强治疗反应和细胞持久性的另一种独特方法。
CAR-T细胞疗法与免疫检查点抑制剂或其它免疫调节疗法联合为优化CAR-T临床响应的速度、强度以及持久性提供了一种协同策略。临床样本显示，从回输至“达到增殖高峰”，CAR-T细胞上的PD-1表达增加了。临床前数据表明，阻断PD-1/PD-L1改善了CAR-T细胞治疗的疗效。相关临床试验也提供了这类联合治疗能够改善CAR-T疗法持久性的证据。
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抗原阳性复发的一个潜在解决策略是再次回输（re-infusion）CAR-T细胞进行治疗。但遗憾的是，这种方法似乎作用不大。举例来说，Gardner等[5]给10名儿童和年轻成人ALL患者进行了第二次CD19-CAR-T治疗，其中，有8人体内的CAR-T细胞丧失持久性，仅2名患者在再次输注后CAR-T细胞扩增，仅1名患者获得完全缓解。
优化再次回输的策略包括使用不同的CAR结构，甚至是靶向不同抗原的CAR（如CD22）。举例来说，使用人源化的CD19-CARs来克服鼠源CD19-CARs结构免疫介导的排斥反应是临床试验（NCT02374333）正在测试的一种策略；早期数据表明，这种方法能够诱导完全缓解。
以抗原丢失或调变作为免疫逃逸机制
靶抗原调变是CAR-T细胞诱导缓解后疾病复发最清晰的机制之一（表1）。这也是其它靶向免疫疗法同样遭遇的问题，如单抗或双抗。已经明确的导致CD19表达缺失的机制包括选择性剪接，这种剪切产生的CD19变体靶表位破坏了和/或在细胞表面表达减少，并中断了CD19向细胞表面的转运。其它导致抗原丢失的途径正在积极研究中。
表格来源：Nature Reviews Clinical Oncology
有效CAR-T治疗后的抗原丢失在ALL患者中得到了有力证实，但这种现象肯定不局限于这类癌症。实体瘤的临床前研究以及胶质母细胞瘤患者的临床研究结果同样表明，抗原调变是破坏CAR-T细胞治疗有效性的一个潜在“陷阱”。
表格来源：Nature Reviews Clinical Oncology
尽管已经了解到抗原调变是免疫逃逸的一种机制，但目前还没有足够的能力预测哪些患者会因为这类机制导致疾病复发。为了解决这类机制导致的复发，目前，科学家们正在开发靶向多抗原的CAR结构（表2，如CD19–CD20 CAR、CD19–CD123 CAR、CD19–CD22 CAR），以解决肿瘤固有的异质性，从而降低白血病复发的风险。一些这类双靶向CAR-T疗法已经在开展临床试验。之后的数据将帮助确定是否这种靶向双抗原的途径足以预防疾病复发，以及是否需要同时靶向更多的抗原来帮助CAR-T疗法实现治愈。
未来的研究需要进一步弄清抗原密度在抗肿瘤反应中的作用，鉴定出导致靶抗原表达紊乱的机制，从而优化CAR-T细胞的抗癌作用。
其它机制
谱系转换是另一种逃避CAR-T细胞的机制。举例来说，在临床前ALL模型中用CAR-T细胞靶向FLT3被发现诱导了B细胞向T细胞谱系的可逆转换。不过，这种耐药机制在非白血病恶性肿瘤中是否起作用仍有待确定。
复发后巩固治疗
为了应对复发，一些团队还考虑到了利用其它手段来巩固CAR-T细胞诱导的缓解，如同种异体造血干细胞移植（allo-HSCT），尤其是用于先前未接受过移植的患者。一些初步报告已显示，CAR-T治疗后缓解的儿童或成人ALL患者再接受allo-HSCT，治疗结果总体得到改善。
具体来说，在一项CD19和CD22双靶向CAR-T疗法的临床试验中，25名患者之后接受了allo-HSCT，其中有19名患者是首次接受allo-HSCT。分析显示，25名患者24个月的复发累积发生率为13.5%；而首次接受allo-HSCT的19名患者的相关同期数据为11.3%。尽管如此，减少对巩固疗法的依赖以实现治愈将是优化CAR-T细胞疗法的一个重要目标。
障碍三：毒性作用
在过去的几年里，关于CAR-T细胞疗法毒性作用（尤其是CRS）的深度文章已发表很多。目前，业内正在努力建立统一的分级标准。Lee等人[6]提出的原始CRS分级标准已被更新和发表，并作为美国血液和骨髓移植协会共识指南。优化CAR-T疗法安全性的方法仍在研究中，如结合自杀基因或其它基因工程策略来降低毒性。
严重甚至致命的CRS和其它毒性是某些患者产生持久缓解的障碍。我们必须认识到，关于CRS管理的文献主要是基于从CD19-CAR-T细胞治疗试验中获得的经验。因此，随着这类疗法靶向的抗原越来越多样，认识到并不是所有CRS病例都是相同的非常重要，这会影响相关的应对策略。
此外，目前有限可用的数据表明，早期干预策略可以有效降低CRS的严重程度，而不影响CAR-T细胞扩增的峰值或功能持久性。未来的研究需要建立“消除毒性及其对CAR-T持久性影响”的最佳策略。一项代号为NCT02906371的临床试验正在调查用托珠单抗（IL-6抗体）治疗与CD19-CAR-T疗法相关的CRS的最佳时机。
障碍四：适应症局限
目前，将CAR-T疗法的应用扩展到除ALL外的其它癌症中存在很多障碍。
尽管FDA已经批准Kymriah和Yescarta用于治疗复发和/或难治性大B细胞淋巴瘤，然而，治疗的缓解率并不高。Kymria和Yescarta关键试验的完全缓解率分别为30%[7]和54%[8]。相比之下，CD19-CAR-T治疗 ALL患者的完全缓解率达67%–93%。此外，科学家们对CAR-T治疗这类癌症的复发机制的理解仍有限。
除了血液学肿瘤，开发用于治疗实体瘤的有效CAR-T疗法面临着一系列独特的挑战。固有的肿瘤异质性是一个关键的问题。这一特质阻碍了有效靶点的确定，与此有关的抗原丢失是阻碍缓解的关键因素。不过，也有一些数据表明了用CAR-T治疗实体瘤的潜力：以disialoganglioside GD2为靶点的CAR-T疗法被证明在神经母细胞瘤患者中显示出抗肿瘤活性，导致完全缓解。
此外，克服可能使CAR-T细胞失活的免疫抑制肿瘤微环境对实体瘤CAR-T治疗尤为重要。很多用于克服这一问题的方法正在接受评估，例如，结合免疫检查点抑制、改造CAR-T细胞使其能够分泌促炎细胞因子。
针对中枢神经系统肿瘤，需要仔细考虑CAR-T细胞疗法的最佳递送机制。2016年，NEJM上的一篇论文[9]描述了一个病例：一名胶质母细胞瘤患者接受了靶向IL-13Rα2的CAR-T疗法的治疗，7个月里，通过两条颅内递送途径进行了多次CAR-T回输。患者的临床响应令人印象深刻，所有颅内和脊柱肿瘤完全消退持续了7.5个月。其它研究中使用的递送途径还包括脑室内注射。
总结
总结来说，综述指出，CAR-T细胞疗法是有史以来最有前途的抗癌疗法之一，但想要所有接受这类疗法的患者都获得安全持久的缓解仍面临着许多挑战。克服以上提出的“四大障碍”是让CAR-T疗法更有效、更“普适”的关键。
相关论文：
[1] Nirali N. Shah etal. Mechanisms of resistance to CAR T cell therapy. Nature Reviews Clinical Oncology (2019) .
[2] 王云飞等. CD3/CD28免疫磁珠法体外扩增外周血T淋巴细胞. 《细胞与分子免疫学杂志》（2014）.
[3]Joseph A. Fraietta et al. Disruption ofTET2 promotes the therapeutic efficacy of CD19-targeted T cells. Nature(2018).
[4] Justin Eyquem et al. Targeting a CAR tothe TRAC locus with CRISPR/Cas9 enhances tumourrejection. Nature (2017).
[5] Rebecca A. Gardner et al.Intent-to-treat leukemia remission by CD19 CAR T cells of defined formulationand dose in children and young adults. Blood (2017).
[6] Daniel W. Lee et al. Currentconcepts in the diagnosis and management of cytokine release syndrome. Blood (2014).
[7] Stephen J. Schuster et al. Primaryanalysis of Juliet: a global, pivotal, phase 2 trial of CTL019 in adultpatients with relapsed or refractory diffuse large B-cell lymphoma. Blood (2017).
[8] Sattva S. Neelapu et al. Axicabtageneciloleucel CAR T-cell therapy in refractory large B-cell lymphoma. NEJM(2017).
[9] Christine E. Brown et al. Regression ofglioblastoma after chimeric antigen receptor T-cell therapy. NEJM (2016).