PCR注意事项
对于 PCR 实验，污染主要是指含有 DNA 的微小液体颗粒的气溶胶污染，这些污染是从何而来呢？排除人为因素（错误操作等）和操作人员本身（头发、皮屑等）因素，在样品制备、 PCR 扩增和 PCR 前 / 后的实验操作中，都可能会引起气溶胶污染。按照产生方式，可分为 移液器引起的污染、PCR 仪引起的污染和 PCR 产物分析引起的污染（如图所示）
医疗机构临床基因扩增检测实验室 根据卫生部 2010 年颁布的《医疗机构临床基因扩增检验实验室工作导则》，临床基因 扩增检验实验室需要设置四个隔开的工作区域中，即试剂储存和准备区、标本制备区、扩增区和扩增产物分析区（全自动核酸扩增 仪，如定量 PCR 仪时，产物分析区可以和扩增区合并），各个区域的功能如下：试剂储存和准备区：贮存试剂的制备、分装和扩增反应混合液的配制（最好在超净工作台中 进行）；标本制备区：核酸（RNA、DNA）提取（视样品情况可在生物安全柜中操作）、 贮存及其加入至扩增反应管；扩增区：DNA 和 cDNA 的扩增及检测（定量 PCR 分析）， 巢式 PCR 测定的第二次加样必须在扩增区进行；扩增产物分析区：扩增片段的进一步分析测定。
进入各个工作区域必须严格遵循单一方向顺序，通过传递窗传递样品，气流方向也要按照单一流向，要从洁净区到污染区，可按照上述隔间顺序空气压力递减的方式进行，防止扩增产物随气流进入上游区域。其中标本制备区可设立正压条件，避免从邻近区进入本区的气溶胶污染。扩增区和扩增产物分析 区是产生 PCR 产物气溶胶的主要区域，所以可设立负压条件，避免气溶胶外泄。基因扩增实验室控制气流的方式通常是通过实验室的相对正压或负压来达到目的，如安装排风扇、负压排风装置、空调通风系统等，最好采用全送全排方式，条件和空间允许的话，每个区域可设定缓冲区。
用于确定 PCR 反应是否成功、产物条带位置及大小是否合乎理论要求的一个重要的参考标志，用于监测试剂质量，在体系构建阶段引入，帮助我们排除假阴性结果。阳性对照要选择扩增度中等、重复性好，经各种鉴定是该产物的标本，如以重组质粒为阳性对 照，其含量宜低不宜高（100 个拷贝以下）。
如果阳性对照结果是阴性，可以确定 PCR 试剂失效，最大可能是 Taq 酶失活。
帮助我们排除由于 PCR 抑制条件导致的假 阴性结果的对照，亦可称做 PCR 抑制剂对 照，通常使用外源 DNA，且在竞争 PCR 中具有扩增优势。
在 DNA 提取和 PCR 准备步骤引入阳性内 对照，同一 PCR 反应管中即包含 IPC DNA 和引物，又包含样品 DNA 和引物，当存在PCR 抑制剂或 DNA 样品中蛋白质去除不彻 底，将只有 IPC PCR 产物扩增，那么需要 对 DNA 样品进行进一步纯化。
是指用水代替模板 DNA 进行 PCR 反应，需要在每次实验中进行。空白对照的使用能够 帮助我们确定 PCR 反应中所使用的溶液和试剂是否存在污染，帮助我们排除假阳性结果。
如果空白对照出现阳性结果，则表示反应过程中存在交叉污染或者实验室空气存在污染，与环境对照结果结合判断污染源，如环境对照呈现阴性结果，需要尽量更换使用的溶液和试剂。
用于确定实验空气中是否存在气溶胶污染， 在 PCR 实验从试剂准备、样品制备到核酸 制备和 PCR 扩增准备四个阶段均需设置，该对照是在管中加入不含核酸的适量体积的水，在样品测试整个过程中均敞开与空气接 触（GBT19495.1-2004），与样品同时进行 PCR 反应。
如果结果显示阳性，那么提示某个房间或者分区已经出现气溶胶污染。
用于验证在无目的模板 DNA 的条件下，是否有假阳性结果产生，同时可以验证引物的特异性。适用于进行多个模板扩增的实验室、 临床诊断实验室或者从事 PCR 诊断试剂盒 研发的实验室，在PCR体系构建阶段引入，正常情况下，无关模板无法被扩增。
如果外源模板阴性对照显示阳性结果，那么 需要排除目的模板 DNA 的污染情况；如果 无模板 DNA 污染，那么说明引物的特异性差，需要重新设计引物。
根据 PCR 实验目的不同，还可设置核酸提 取空白对照对提取试剂进行质控；PCR 抑 制剂对照对 DNA 中是否含有 PCR 抑制剂进行质控；弱阳性目标序列对照对方法检测低限进行质控。
3.1.1 UNG- 热启动 Taq 酶系统 使用尿嘧啶 DNA- 糖苷酶（UNG），并用脱 氧尿苷三磷酸（dUTP）代替脱氧胸腺三磷 酸（dTTP），用于防止 dUTP 标记的 PCR产物。
尿嘧啶 DNA- 糖苷酶（UNG）的作用原理 是：选择性水解断裂含有 dU 的双链或单链 DNA 中的尿嘧啶糖苷键，形成的有缺失碱 基的 DNA 链，在碱性介质以及高温下会进一步水解断裂，从而被消除。最佳活性温度 为 50 °C，95 °C 即可灭活。高品质的 UNG 酶可以消除高达 108 的 U-DNA 产物，和热 启动 Taq 酶一同用于建立含有 UNG/dUTP 防污染体系的热启动 PCR 反应系统。
对于所有的核酸污染均有效，但是不能消除所有污染，只能将污染降低几个数量级， 而且当 DNA 片段小于 300bp 时，消除污染 的效果很差（Sarkar and Sommer 1990， 1991），适合进行大面积实验台及实验室环境的定期消除方法，也可以用于工具、耗材和样品架的污染消除。
紫外线照射后 DNA，发现有几个变化，其中最明显的变化是同一链上的两个邻接嘧啶核苷酸的共价联结，形成嘧啶二聚体 (thymine dimer,T T )，此外还有胞嘧啶二聚体腺（CC）以及胸嘧啶和胞嘧啶二聚体 （CT）。这些嘧啶二聚体使双螺的两链的键 减弱，使 DNA 结构局部变形，严重影响照射 后 DNA 的复制和转录。含有嘧啶二聚体的 DNA 的链不能作为 DNA 复制的样板，新合 成的链在二聚体的对面和两旁留下了缺口 。
由于紫外照射的距离和能量对去除污染的效果非常关键，工作台面可在工作完成后 使用可移动紫外灯（254 nm），调至实验台 上 60-90 cm 内照射（《医疗机构临床基因扩增检验实验室工作导则》）；实验室定期进行紫外照射可降低污染几率，安装要求： 每 20 m2 安装一支 40 W 的紫外灯（254 nm），距离地面距离不宜超过 2.0 m±0.1 m（GBT19495.2-2004），各个实验室需要根据实际情况开展。
可选择次氯酸钠 (5-10%)、 甘氨酸—盐酸 缓冲液、 1 mol/L 盐酸，进行台面、操作工具、样品架、塑料及玻璃器皿的清洁。
> 次氯酸钠（5-10%）
氯属于快速作用的氧化剂，是一种可广泛应用的广谱化学杀菌剂。它一般作为漂白剂销售，使用时可以用水稀释成各种不同的有效氯浓度。
> 甘氨酸—盐酸缓冲液 /1 mol/L 盐酸
10× 甘氨酸—盐酸缓冲液配制方法：30.6 g 氯化钠（Na Cl），39.2g 甘氨酸（Glycine）， 523 mL 水（H2O）， 溶 解 后 加 入 1 N 盐 酸（HCl）至 1000 mL，使用时请稀释到 1×。稀酸可以使得 DNA 脱嘌呤，从而失 去作为 PCR 模板 DNA 的可能。
3.2.1 使用 60% 异丙醇 / 70-75% 乙醇 乙 醇（C2H5OH） 和 异 丙 醇［（CH3） 2CHOH］具有相似的灭菌特性。它们对于 繁殖的细菌、真菌和含脂病毒具有活性，但不能灭活孢子，而对非含脂病毒的作用则不确定。作用机理是醇类分子进入到蛋白质分子的肽链环节蛋白质变性，并能够渗透到细菌体内破坏细胞壁和微生物酶系统。
醇类溶液的主要优点是处理后物品不会留下任何残留物。适用于工具及样品架的微生物取出和台面清洁。
紫外照射灭菌原理主要是破坏微生物的染色 体（3.4.1.2），主要用于台面、工具、耗材、样品架的表面灭菌，适合于大面积区域： PCR 工作台和实验室的灭菌，配合 70-75%乙醇可提高灭菌效果。
高压蒸汽灭菌是生物学实验室对实验材料灭菌最有效和最可靠的方法，适用于工具，溶 液，耗材的灭菌方式。Eppendorf 移液器可进行高压灭菌（依照不同型号，请参照厂家说明书）。
Eppendorf作为一家有着70多年历史的生命科学实验室设备供应商，始终坚持客户第一，不断为我们的客户提供高品质和持续创新的产品及服务。面对这次病情，我们希望尽最大可能为战胜病毒做出一份贡献，同时也希望我们的产品能够在实验的方方面面守护实验人员的安全。