细胞转染技术 | 从入门到精通
概念：概括地说，转染是使用非病毒感染的手段人工引入核酸（DNA或RNA）进入细胞的过程。转染的目的是产生重组蛋白，或特异性增强或抑制转染细胞中的基因表达。转染的类型根据导入的核酸存在于宿主细胞的时间长短，可以分为瞬转和稳转。根据转染方式可以分为化学，生物，物理方法。瞬转：因为导入的核酸没有整合到宿主细胞基因组，因此它只会短暂地存在于宿主细胞中，不会随着细胞的分裂而进入到子代细胞中。然而，导入的遗传物质的高拷贝数导致其在细胞内的蛋白质表达水平较高。根据所使用的载体的不同，瞬转通常可以1至7天内进行基因检测，但是瞬时转染的细胞通常在转染后24-96小时收获。当使用超螺旋质粒DNA时，瞬时转染的效果最好，推测是由于超螺旋质粒DNA能更有效地被细胞摄取。稳转：外源DNA整合到细胞基因组中或作为附加体质粒保留在细胞中。与瞬时转染不同，稳定转染允许外源DNA在转染的细胞及其后代中的长期维持。然而，通常是将单拷贝或几个拷贝的外源DNA整合到稳定转染的细胞的基因组中，因此，其表达水平一般低于瞬时转染的表达水平。由于稳转效率较低，因此选用有效地转染策略和筛选方法很重要。其中比较可靠地筛选方法是在DNA载体中包含选择性标记，然后在细胞转染短暂性恢复后进行适当地选择性加压。尽管相对于超螺旋DNA，线性DNA被细胞摄取的效率较低，但其能最有效地整合到宿主基因组中。目前，由于各种转染试剂的发明，哺乳动物细胞的瞬时转染已经用于生产具有适当折叠和翻译后修饰的重组蛋白。但表达mg/L-g/L的重组蛋白主要依赖于稳定细胞系的产生。瞬转和稳转的比较瞬转稳转导入的DNA没有整合到基因组中，而是保留在细胞核上导入的DNA整合到基因组中导入的遗传物质不传递到子代；遗传改变只是暂时的导入的遗传物质能够代代相传；遗传改变是永久的不需要选择性筛选需要选择性筛选出稳定转染的细胞DNA载体和RNA都可用于瞬时转染只有DNA载体可用于稳定转染；RNA本身不能稳定地导入细胞中导入的遗传物质的高拷贝数导致高水平的蛋白质表达。单拷贝数或低拷贝数的稳定整合的DNA导致较低水平的蛋白质表达。通常在转染后24-96小时内收获细胞。需要2-3周的时间筛选出稳定转染的细胞克隆。通常不适合使用具有诱导型启动子的载体的研究。适用于使用带有诱导型启动子的载体的研究。转染方式细胞由带负电荷的磷脂双分子层构成，这对大分子物质来说是个不可透过的屏障，比如DNA和RNA的磷酸骨架，其也带负电荷。为了使核酸穿过细胞膜，研究人员开发了多种技术，大致分为三类：化学方法---利用载体分子包被核酸使其呈现中性电荷或正电荷。生物方法---利用基因工程病毒转染非病毒基因到细胞中。物理方法---在细胞膜表面产生一个瞬时的孔从而导入DNA。然而，没有一种方法适用于所有的细胞和实验，理想的方法应根据您的细胞类型和实验需要进行选择，理想的方法应具有高转染效率，低细胞毒性和对正常生理学的影响最小，并且易于使用和可重复性等特点。化学转染方法技术优点缺点阳离子脂质体操作快速简单结果可重复转染效率高可转染DNA，RNA和蛋白质适用于生产瞬时和稳定的蛋白质可用于体内转染需进行条件优化(一些细胞系对阳离子脂质体较敏感)有些细胞系不容易转染血清的存在干扰复合物的形成，导致低转染效率培养基中血清的缺失会增加细胞毒性磷酸钙共沉淀便宜且容易获得适用于生产瞬时和稳定的蛋白质转染效率高（不限制细胞系）需要仔细制备试剂 – CaPO4溶液对pH，温度和缓冲盐浓度的变化敏感可重复性较差有细胞毒性，尤其对原代细胞不能采用RPMI培养基，由于其含高浓度的磷酸盐不适用于动物体内转染葡聚糖操作简单结果可重复便宜对某些细胞有化学毒性只限于瞬时转染转染效率低，尤其在原代细胞中其他阳离子聚合物在血清中稳定，对温度不敏感高转染效率（限制细胞系）结果可重复对某些细胞有毒性不能生物降解（树枝状大分子）只限于瞬时转染生物转染方法病毒转染高转染效率（对原代细胞有80-90%）适用于较难转染的细胞系可用于体内转染可用于构建稳定表达或瞬时表达的细胞系被转染的细胞系必须含有病毒受体基因插入大小受限（病毒载体~10 kb，非病毒载体~100 kb）技术难度高，且构建重组蛋白很费时存在生物安全问题（激活潜在疾病，免疫原性反应，细胞毒性，插入突变，使细胞恶性转化）物理转染方法电转原理简单条件优化后可产生重复性的结果不需要载体不限制细胞类型和条件条件优化后可以快速转染大量细胞需要特殊的设备需要优化电转脉冲和电压参数对细胞伤害很大细胞死亡率很高因此需要大量细胞会不可逆转地损坏细胞膜，溶解细胞生物传递粒子传递（粒子轰击）不限制细胞类型和条件可用于动物体内转染方法直接，结果可靠不限制导入基因的大小和数量主要用于基因疫苗和农业应用需要昂贵的设备会对样品产生物理损伤细胞死亡率很高因此需要大量细胞需要准备微粒转染效率相对较低对于研究应用成本较昂贵显微注射不限制细胞类型和条件可以单细胞转染方法直接，结果可靠不限制导入基因的大小和数量不需要载体需要昂贵的设备有技术要求，且是劳动密集型（一次只能转染一个细胞）常引起细胞死亡激光介导的转染（光转染）可用于转染DNA，RNA，蛋白质，离子，葡聚糖，小分子和半导体纳米晶体可用于非常小的细胞允许单细胞转染或同时转染大量细胞不需要载体转染效率高适用于多种细胞系需要昂贵的激光显微镜系统需要贴壁细胞有技术要求阳离子脂质体介导的转染原理：阳离子脂质体介导的转染是目前最常用的转染方式之一。阳离子脂质的基本结构由带正电荷的头基和一个或两个烃链组成，带正电荷的头基与带负电荷的核酸通过静电作用形成复合物，经细胞的内吞作用进入细胞。LifeTechnologies™提供了广泛的阳离子脂质介导的转染试剂，用于有效地将DNA，RNA，siRNA或寡核苷酸引入广泛的细胞类型，包括Lipofectamine®3000试剂。当选择转染试剂时，您必须考虑您希望导入（DNA，RNA或蛋白质）的有效载荷以及要转染的细胞类型，因为转染试剂的选择强烈影响转染结果。
实验步骤：将DNA，RNA，siRNA或寡核苷酸和转染试剂分别在不同的管中稀释→将两者混合形成混合物→将形成的混合物加入细胞中，脂质体的正电荷有助于帮助复合物粘附到细胞膜上→复合物经细胞内吞作用进入细胞→检测基因表达或沉默情况。磷酸钙共沉淀原理：将DNA与氯化钙在磷酸缓冲盐水中混合形成磷酸钙-DNA沉淀物，然后将其分散在培养的细胞上，磷酸钙促进共沉淀物中的缩合DNA与细胞表面的结合，DNA通过内吞作用进入细胞。实验步骤：将氯化钙和DNA混合，以可控的方式加入磷酸缓冲液。→在室温下孵育，以形成极细，可溶的共沉淀微粒→将磷酸钙-DNA沉淀物加入细胞中，后者能黏附到细胞膜表面→共沉淀物经细胞内吞作用进入细胞→检测基因表达或沉默情况。病毒转染原理：对于用脂质体不能实现转染的细胞，可以采用病毒转染。腺病毒，逆转录病毒和慢病毒载体已广泛用于哺乳动物细胞体内外的基因转染。
实验步骤：通过基因克隆方法获得重组病毒表达载体→转染包装细胞系，扩增并分离得到重组病毒颗粒→纯化并滴定病毒液→转导目的细胞（含有病毒特异性的受体）→从培养基中移除病毒→检测基因表达或沉默情况。电转原理：利用电脉冲在细胞膜上形成暂时的孔使核酸物质能穿过孔进入细胞。
实验步骤：利用电转缓冲液重悬细胞→对含有核酸，缓冲液，细胞的混合物给予合适的电脉冲→电脉冲在细胞膜上形成电势差，诱导产生暂时的孔使核酸进入细胞→将细胞返回到生长培养基中，使其慢慢恢复→检测基因表达或沉默情况。转染的影响因素转染过程中许多因素会影响转染效率：如细胞种类、细胞密度；质粒大小、质粒纯度；血清；抗生素；转染试剂等。转染实验中，以下几个因素需多加注意。1. 转染前的细胞状态和密度转染时细胞密度以 70~90%（贴壁细胞）或 2×106~4×106细胞 / mL（悬浮细胞）为宜，细胞密度过高会严重影响细胞状态（周期进程阻滞，凋亡增加等）。转染效率随着细胞传代次数不同会发生很大变化，因为传代次数少的细胞转染率非常低，而对传代次数较多的细胞而言，其转染最佳剂量差别较大。同时支原体污染会严重降低细胞的转染效率，因此转染前可用环丙沙星处理细胞以除去支原体。2. 转染时的质粒纯度假使质粒不纯，如带少量盐离子，蛋白、代谢物污染等都会显著影响转染复合物的有效形成；而含有内毒素的质粒对细胞存在很大的毒性作用。抗生素一般对真核细胞无毒，但转染过程中细胞通透性增加，使抗生素进入细胞，从而降低细胞活性，导致转染效率低下。3. 转染后的筛选时间转染后筛选不能太早或太晚，因为转染了外源基因的细胞代谢负荷大，增殖较慢，太晚会被没有外源基因转入的细胞所淹没，最终导致筛选不出阳性克隆。一般要在转染 48 h 之后开始加抗生素筛选。
转染流程示意图4. DNA 与转染试剂的比例许多转染方法需要优化 DNA 与转染试剂的比例。不同细胞系转染效率通常不同，细胞系的选择通常根据实验需要确定。在转染前应根据实验要求和细胞特性选择合适的转染试剂，不同转染试剂转染效率差别很大，好的转染试剂能让您事半功倍。来源：本文直接转自BioMan，生物制品圈、义翘神州。仅用于学术分享，如有侵权，请联系我们处理！