国自然热点：应激下mRNA的选择性翻译，这篇15分 的文章教你如何完美论证！
热休克反应（HSR）是一种古老的信号通路，几乎介导了所有有机体对热刺激保护反应。有证据表明，细胞内O-GlcNAc修饰是一种分子“温度计”，报告了周围环境温度波动。那么O-GlcNAc修饰是否调控HSR？若调控，如何调控？这篇文章同样来自康奈尔大学钱书兵课题组（“m6A还能调控蛋白翻译？没有动物实验照样17分+！”），发表在15.04分的Nature Chemical Biology上。文章第一次筛选到eIF4GⅠ蛋白，将其与O-GlcNAc修饰相联系，用eIF4GⅠ上O-GlcNAc修饰的有无作为“开关”解释了为什么应激条件下应激相关mRNA翻译被选择性增强，而常规mRNA翻译被抑制。
热休克反应（HSR）在进化上高度保守，诱导了编码分子伴侣的基因迅速表达，这对细胞保护和损伤细胞恢复非常重要。在HSR中，总蛋白合成被抑制而应激相关Hsp70蛋白被诱导选择性表达。
HSR中，可在电镜下观察到应激颗粒（SGs）的聚集，内含离散的RNA-蛋白结构及不可翻译mRNA。SGs被证实影响mRNA翻译及其稳定性，并参与细胞凋亡。然而尚不清楚SG形成过程中mRNA的分流，以及其是否参与选择性翻译过程。
O-GlcNAc修饰被认为是一种报告周围环境温度波动分子“温度计”，OGT介导蛋白O-GlcNAc修饰，OGA介导蛋白去O-GlcNAc修饰。细胞应激时总蛋白O-GlcNAc修饰水平升高，但哪种蛋白的O-GlcNAc修饰参与了细胞应激？有何生物学意义？问题仍待解决。
文章背景图
文章思路图
1、OGT-缺失细胞中Hsp70表达不足【差异表达】
作者构建OgtF/Y(mER-Cre) MEF细胞，加入4HT可清除Ogt基因。如图，WB示HS后OGT敲除组OGT、O-GlcNAc修饰细胞总蛋白、Hsp70均不表达，而WT组均表达。qPCR示HS后OGT敲除组与WT组细胞内总Hsp70 mRNA等量，出现转录本丰度变化 ≠ 蛋白质丰度变化，即O-GlcNAc修饰对 Hsp70 表达存在翻译调控。进一步用polysome profiling检测两组细胞中正在翻译的Hsp70 mRNA，结果示OGT敲除组结合核糖体的Hsp70 mRNA显著低于WT组，表明OGT敲除组Hsp70 mRNA鲜少翻译，与蛋白结果相一致。即HSR中，细胞内OGT敲除导致Hsp70 mRNA翻译被显著抑制，Hsp70蛋白不表达。
图1
2、eIF4GⅠ在热应激中发生动态O-GlcNAc修饰变化【目标蛋白锁定】
业已证明，细胞内OGT敲除抑制Hsp70 mRNA翻译，预示着细胞内某种蛋白的O-GlcNAc修饰介导了Hsp70蛋白在HSR中的表达。作者将目标定位在核糖体蛋白与翻译因子中，因此WB检测了MEF细胞在HS前后细胞内O-GlcNAc修饰总蛋白及Hsp70蛋白的表达，结果示250KD处，该蛋白的O-GlcNAc修饰在HS后1h出现、2h达高峰、4h减弱、6h消失，提示该蛋白的O-GlcNAc修饰对HS极度敏感，且Hsp70蛋白出现在HS后2h，恰好在该蛋白O-GlcNAc修饰之后，高度提示该分子量为250KD的蛋白为目标蛋白。作者查阅资料发现eIF4GⅠ分子量与250KD相近，因而设计OgtF/Y(mER-Cre) MEF中co-IP，见WT组HS后eIF4GⅠ沉淀复合物O-GlcNAc修饰水平显著升高，而OGT敲除组未沉淀出O-GlcNAc修饰。为确定eIF4GⅠ沉淀复合物O-GlcNAc修饰是否为eIF4GⅠ，作者纯化eIF4GⅠ沉淀复合物后质谱，结果示eIF4GⅠSer68为唯一O-GlcNAc修饰位点。体外构建鼠YFP-flag-eIF4GI并转染MEF细胞，S68A废止了HS诱导eIF4GⅠ的O-GlcNAc修饰，而WT和S1285A不影响。因此，HSR中eIF4GⅠSer68发生O-GlcNAc修饰，随后以某种机制介导了Hsp70蛋白的选择性表达。
图2
3、eIF4GⅠ的O-GlcNAc修饰排斥了PABP1【机制探索1】
HSR中eIF4GⅠSer68的O-GlcNAc修饰与Hsp70蛋白的选择性表达高度相关，然而其具体作用机制是什么？作者从eIF4GⅠ的结构和功能入手，针对eIF4GⅠ上的PABP1、eIF4E、eIF4A、eIF3等结合位点，co-IP检测HS前后，eIF4GⅠ与这些蛋白相互作用的变化，结果示在WT细胞，HS后eIF4GⅠ与PABP1结合减少，与eIF4E结合不受影响。在Ogt敲除细胞，HS后eIF4GⅠ与PABP1和eIF4E结合不受影响。以eIF4E、PABP1为抗体的相互共沉淀示eIF4E可将修饰与非修饰的eIF4GⅠ沉淀下来，而PABP1只能沉淀极少的eIF4GⅠ且无O-GlcNAc修饰，证实了应激诱导的O-GlcNAc修饰eIF4GⅠ通过解离PABP1重构组装成eIF4F（介导帽依赖翻译起始）。而O-GlcNAc修饰eIF4GⅠ显然抑制了帽依赖的翻译起始，并通过重构eIF4F激活了非帽依赖的翻译起始，故作者希望检测应激条件下eIF4E对细胞内mRNA亲和力的变化。零距紫外交联+PCR示，WT组HS后eIF4GⅠ与Hsp70 (Hspa1a) mRNA结合增高6倍，符合预期。而敲除OGT后，HS后eIF4GⅠ与Hsp70 (Hspa1a) mRNA结合增高25倍甚至显著高于WT组，可先前WB已证实HS后PGT敲除组Hsp70蛋白不表达，因而细胞内存在大量Hsp70 mRNA却不表达，这是SG的特征！体外构建YFP-flag-eIF4GⅠ和S68A突变质粒转染MEF细胞，零距紫外交联+PCR示，S68A突变组较WT组Hsp70 (Hspa1a) mRNA显著富集。故应激诱导O-GlcNAc修饰eIF4GⅠ可能释放了SG中应激相关mRNA。
图3
4、去O-GlcNAc修饰的eIF4GⅠ抑制了SG的解离【机制探索2】
SG为不可溶性，作者试图研究eIF4GⅠ、PABP1、eIF4E等蛋白在HS前后的可溶性差异。WB示从HS恢复后OGT敲除组可溶性eIF4GⅠ数量减少，PABP1和eIF4E同样在HS后减少，提示可能是参与形成细胞质内应激颗粒（SG）。进一步免疫荧光示，HS后，WT组SG特征性荧光显著减弱，而OGT敲除组SG特征性荧光不变，提示细胞内缺乏O-GlcNAc修饰导致HS后SG的分解被抑制。那么O-GlcNAc修饰eIF4GⅠ是否可分解SG，释放Hsp70 (Hspa1a) mRNA？FISH示，WT组Hsp70 (Hspa1a) mRNA广泛分布在细胞质中，OGT敲除组Hsp70 (Hspa1a) mRNA与SG信号重叠，提示细胞内缺乏O-GlcNAc修饰时，Hsp70 (Hspa1a) mRNA很大程度上集中于SG中。体外构建YFP-flag-eIF4GⅠ和S68A突变质粒转染MEF细胞发现，HS后，S68A突变组较WT组维持了SG的生成，表明HS诱导eIF4GⅠ的O-GlcNAc修饰释放了SG中的应激相关mRNA，从而允许其选择性翻译。
图4
5、eIF4GⅠ的N端通过O-GlcNAc修饰起功能开关的作用【加强验证1】
基于OGT敲除的MEF细胞中，包括eIF4GⅠ在内的广泛蛋白O-GlcNAc修饰发生变化。为增强论证的说服力和严谨性，作者利用CRISPR/Cas9构建特异性表达eIF4GⅠ的a/b/c/d/e五种亚型的细胞，分别含或不含Ser68及PABP1结合位点。co-IP示，含Ser68的a/b亚型可被O-GlcNAc共沉淀，即HS后发生O-GlcNAc修饰的是eIF4GⅠN端。在Ser67密码子前插入A，构造框移突变，HS后eIF4GⅠ短链亚型取代全长亚型，在缺乏O-GlcNAc修饰位点和PABP1结合位点的情况下，Hsp70的合成依旧活跃，但HS后eIF4GⅠ短链亚型并不改变其溶解性以及维持SG生成的能力，即eIF4GⅠ与PABP1的相互作用对于维持SG生成至关重要，但对Hsp70的选择性翻译非必需。构建缺失突变的eIF4GⅠ，其不含O-GlcNAc修饰位点，但可与PABP1结合，与插入突变的eIF4GⅠ（不含O-GlcNAc修饰及PABP1结合位点）对比WB示，HS后，缺失突变组eIF4GⅠ可溶性减弱，形成了更多SG，且Hsp70的合成减少，即在HS后的恢复过程中，SG的解离与mRNA的选择性翻译是协调的。
图5
6、eIF4GⅠ变体对SG解离及Hsp70翻译的挽救作用【加强验证2】
作者试图完善rescue试验以使论证严谨，在体外构建含或不含Ser68及PABP1修饰位点的4种eIF4GⅠ质粒，转染eIF4GⅠ细胞。WB联合免疫荧光示，转染WT eIF4GⅠ后恢复了HS后Hsp70的表达以及SG生成，转染S68A突变体后不能恢复eIF4GⅠ敲除细胞的HS诱导的Hsp70表达，M197和M457突变恢复了eIF4GⅠ敲除细胞的HS诱导的Hsp70表达，但不可恢复SG生成，证明了稳定的PABP1结合位点并不是Hsp70选择性翻译所必须的。
图6
eIF4GI和PABP1之间的动态相互作用是调控SG生成和mRNA选择性翻译的关键。在正常生长条件下，eIF4GI和PABP1的持续关联促进帽依赖的mRNA翻译，同时在热应激诱导的翻译阻滞后触发SG生成。应激诱导的eIF4GI的O-GlcNAc修饰使PABP1解离，从而溶解SG，然后选择性翻译应激相关mRNA。eIF4GI作为一个功能开关，它是通过N端可逆的O-GlcNAc修饰来控制与PABP1的直接相互作用，从而协调了SG的诱导和应激相关mRNA的选择性翻译。
文章论证详实，层层递进。从OGT敲除后，细胞内Hsp70的转录本与蛋白质水平变化差异引出翻译调控的存在。再利用co-IP与质谱技术根据蛋白对HS的敏感性及与Hsp70的先后出现顺序筛选了eIF4GⅠ作为翻译调控的核心蛋白，Ser68为唯一O-GlcNAc修饰位点。随后，依据HS前后eIF4GⅠ与其相互作用蛋白如PABP1、eIF4E相互作用差异推论出HS后，体内mRNA以非帽依赖方式翻译起始，并根据HS前后eIF4E对OGT敲除组Hsp70 mRNA高亲和力与低蛋白表达的不对应，推测应激诱导O-GlcNAc修饰eIF4GⅠ可能释放了SG中应激相关mRNA，从而允许其选择性翻译，并在WB与免疫荧光中证实。最后，为增强论证严谨性，作者利还用CRISPR/Cas9编辑细胞使其特异性表达含或不含Ser68或PABP1结合位点的eIF4GⅠ亚型，并用基因突变敲除eIF4GⅠ表达后转染各eIF4GⅠ亚型质粒进行rescue实验。