【烧脑知识点】氢气生物学机理之：氢气与乙酰胆碱酯酶

作为远古地球大气中的主要成分，氢元素是生命体最基本的元素，与碳元素共同构成了碳基生命（C-H）的构架，与氧（O-H）、氮（N-H）、硫（S-H）等元素除了形成共价键，还可以形成氢键等弱相互作用，这是生物大分子形成高级结构和发挥功能的重要推动力。基于氢化酶功能的能量代谢网络，使得氢气担负了推动原初真核生物诞生的关键因素。现代的高等生物依然保留有远古时代氢气代谢的能力，如肠道微生物群落在肠道内组成了庞大的产氢和用氢的氢交换市场，在膳食和宿主之间起到了重要的桥梁作用，与其寄居的生物体共同构成了超级生物体；包括真核生物的线粒体电子传递链在内的多种复合物Ⅰ与氢化酶高度同源。

那么，构成真核生物细胞的生物大分子与氢气是否会直接发生作用呢？我认为这种可能性是存在的，后边的几篇将重点介绍我们在这方面的初步实验证据，乙酰胆碱酯酶是第一个被发现可以与氢气作用的生物大分子。

关于氢气和乙酰胆碱酯酶的研究非常偶然。2012年孙学军教授到北京工业大学讲氢气生物学，这之前我虽然对这个领域有一点接触但半信半疑，孙教授的讲授引发了我的兴趣，我开始思考从哪个角度入手研究氢气。当时的考虑是这个研究应该和健康密切相关。我刚好在申报关于农药耐药问题的项目，对农药的健康危害的防护很关注，就决定由博士生赵岭试一试，研究氢气对目前使用最为广泛的一类化学合成杀虫剂有机磷农药造成的脑损伤是否会有帮助。

氢气对农药造成的脑损伤的保护作用

有机磷农药分为剧毒类（甲拌磷，对硫磷等）、高毒类（甲基对硫磷，氧化乐果、敌敌畏等）、中毒类（敌百虫、乐果、毒死蜱等）和低毒类（马拉硫磷、氯硫磷）。剧毒类和高毒类已经被禁用，我们选择常用的中毒类的毒死蜱（chlorpyrifos,CPF)开展研究。

研究选用大鼠作为对象，每日喂食CPF八周，有一组同时每天饮用氢水，研究结果显示，氢水组CAT、MDA、SOD和GSH等抗氧化指标都有改善，这些结果基本符合预期，与已经报道的氢气抗氧化功能一致。但脑组织神经元染色的结果还是让我们很吃惊，染毒大鼠脑的海马区神经元损伤严重，氢水染毒组神经元明显改善，表明氢气在对抗有机毒性物质损伤方面有积极的作用。据此我们提出来氢气对同样是有机毒物的雾霾、毒品、烟等的毒性氢气也许也可以有对抗作用，因为这个研究有另外两个结果引起了我的兴趣，抗毒方面的研究我们没有继续扩展，但我们欣喜的看到后来有多个研究进一步证明氢气的抗毒作用。

尼氏染色检测CPF对大鼠脑海马区神经元的损伤及氢的保护作用 Wang T，et al., 2014

2007年，日本太田成男教授提出氢气与羟自由基和过氧亚硝酸根等毒性自由基直接反应的选择性抗氧化理论（Ohsawa，2007），这个阶段的研究多集中在CAT、MDA、SOD和GSH等抗氧化指标的测定，并证明氢气确实具有抗氧化作用。我们关于氢气保护农药造成的脑损伤的研究在抗氧化方面与已有的报道基本一致，但有两个结果引起了我的重视：一个是氢气对线粒体的保护作用，另一个是对AChE酶活性的影响。因为这两个方向没有研究报道，我们决定向这两个方向探索。

乙酰胆碱酯酶（Acetylcholinesterase，AChE）是有机磷农药CPF的直接靶点是，判断动物模型是否成功需要测定血清和脑的AChE的酶活性。结果发现，CPF引起大鼠血清和组织中AChE酶活性的下降，氢气组的酶活则比染毒组高。正常对照组血清中AChE酶活为（1.07±0.049）U/ml，CPF暴露组大鼠血清中酶活性降低至（0.69±0.072）U/ml（P<0.05）；染毒期间饮用富氢水的大鼠血清中AChE酶活为（0.94±0.073）U/ml，与CPF组相比酶活性上升了36.23%（P<0.05）。与血清中AChE酶活性变化一致，脑组织中AChE酶活性由于CPF染毒而下降，与正常对照组比降低了62.15%,染毒期间饮用富氢水的大鼠AChE酶活比农药组高近一倍(Wang T，et al., 2014)。

造成血清和脑中AChE酶活高的原因主要有两种可能性，一是基因表达量高从而产生的酶多了；二是有活性的酶多了。检测脑中乙酰胆碱酯酶的基因表达发现，氢气组的基因表达量并没有比农药组高，甚至还略低；剩下的就是第二种可能性，即可能是氢气组有活性的酶的量要多一些，这提示氢的保护作用可能不只限于抗氧化，因此我们决定进一步研究AChE纯酶。

氢气与乙酰胆碱酯酶酶活性

AChE是神经传导中的一种关键酶，主要存在于神经细胞和肌肉细胞之间的突触间。它在突触间耐心地等待，并在神经信号传递后很快开始行动，将乙酰胆碱分解为胆碱和醋酸，有效地阻止了信号的持续传递，终止神经递质对突触后膜的兴奋作用，这是胆碱能神经元激活后恢复到静止状态所必需的反应，否则就可能造成受体细胞膜持续去极化而造成传导阻滞。新生成的胆碱可以被循环利用，并重新构建成新的神经递质，用于下一条信息的传递。AChE是所有酶中反应速度最快的酶之一，可以在80微秒内分解一个分子。越来越多的证据表明，AchE在神经再生、神经退行性疾病等方面也发挥重要作用（Soreq H, et al., 2001）。

乙酰胆碱酯酶在神经突触间的作用

我们在试管中测定了加入氢气后AChE纯酶的活性。看似简单的酶活测定花了几个月的时间，主要原因是AChE具有极高的水解活性，一分子的乙酰胆碱酯酶每秒钟可以水解25000分子的乙酰胆碱，酶动力学测定不容易把握，气体的加入更增加了测定的难度。为了排除可能的干扰因素，商品化的试剂盒不能满足实验要求只能自己配置试剂，包括酶的稀释、氢水的加入时机、试剂的加入顺序等都做了细致的优化。考虑到对照组和氢水组如果分别两次测量操作误差可能掩盖真实的结果，氢水罐（活力氢源）一旦打开气体一直在挥发很难保证两次的氢气浓度一致，两瓶氢水的氢气浓度就更难一致了。所以我们是用96孔板测试，用排枪加样，对照组和氢气组同步开始，加样的同时计时，每个孔从加样启动反应到出来第一个数据都手工记录时间，并尽可能减少这个时间。可能有人要问为什么不用自动加样系统，我们的设备有自动加样系统，但是尝试几次发现无法满足要求，做过气体生物学研究的应该体会比较深。这个实验是我看着两个研究生（刘梦昱和王婷婷，她们自称绝配）做的，我的任务是给她们打下手，负责在旁边计时。

实验的结果印证了我们的推测，氢气确实可以提高酶活性，改变酶反应的各项参数，当加热把氢水中的氢气排出后酶活性就没有变化了（Wang T，et al., 2014）。

调节乙酰胆碱酯酶活性：氢分子的一种新功能 Wang T，et al., 2014

毒死蜱（chlorpyrifos,CPF)进入生物体内是可以被代谢的。在肝脏CPF经细胞色素P450的重要成员CYP2B6催化被转化为毒性物质氧磷毒死蜱（chlorpyrifos-oxon, CPO），肝脏中的对氧磷酶1（paraoxonase 1，PON1）将CPO分解为TCP进行解毒，但是脑中缺乏PON1，CPO与AChE的活性中心反应使酶失活，所以CPF对于脑的损伤一直是重要的研究方向。

有机磷农药CPF在生物体内的代谢

CPO是直接作用于AChE酶的活性中心的抑制剂，在CPO存在下氢气是否会对酶活性有保护呢？我们设计了CPO抑制剂实验，结果发现在有CPO存在时，氢气组的酶活性高于对照组（见图，Wang T，et al., 2014）。这提示氢气处理减弱了CPO对AChE的抑制作用，这种作用有可能发生在酶的活性中心。

氢气与AChE作用的可能机制

AchE酶蛋白有两个能与乙酰胆碱结合的部位：峡谷上面是带负电荷的阴离子部位，可以结合带正电荷的乙酰胆碱，底部是一个发生酯解反应的催化活性位点。

乙酰胆碱酯酶模式图

酶的活性中心是一个相对封闭的空间，其性质与溶液中有所不同，所以称为酶的微环境。例如，有些酶的活性中心是一个疏水的微环境，其介电常数较低，有利于电荷之间的作用，也有利于反应中间物的生成和稳定。

AchE的活性中心含有三个重要的氨基酸，即丝氨酸（Ser）、组氨酸（His）和谷氨酸（Glu），虽然在蛋白质长链上它们并不在一起(200, 400, 327)，但是经蛋白质折叠形成高级结构后，却凑在一起成为“一条直线”。然后发生一件非常重要的事，Glu 抢走中间 His的氢，然后His去抢Ser的氢，最后Ser留下一个光禿禿的氧原子，而此氧原子因失去氢有多余的负电荷而变得极为活跃，可以看作类自由基状态，这就是著名的由 Ser-His-Glu（或Asp)构成的“催化铁三角 (catalytic triad)” 结构。可以看出来，本来活性不高的丝氨酸侧链的羟基（C-OH），在活性中心低介电环境中，羧酸盐的亲核特性通过组氨酸的咪唑环转移到丝氨酸的羟基。氨基酸之间的相互作用依赖于氢键等弱相互作用，由谷氨酸、组氨酸咪唑环的电子偏移构成咪唑环的碱性作用点，与由丝氨酸羟基构成的酸性作用点通过氢键链接，增强了丝氨酸羟基的亲核活性，使之易于与乙酰胆碱结合形成乙酰-酶的中间体，发挥催化功能。

乙酰胆碱酯酶活性中心的“铁三角”结构

AChE水解乙酰胆碱的过程可分为三个步骤：①乙酰胆碱分子结构中带正电荷的季铵阳离子头，以静电引力与胆碱酯酶的阴离子部位相结合；同时乙酰胆碱分子中的羰基碳与AChE酯解部位的丝氨酸的羟基以共价键形式结合，形成乙酰胆碱和AChE的复合物。②乙酰胆碱与酶复合物裂解成胆碱和AChE。③ AChE迅速水解，释放出乙酸，酶的活性恢复。反应过程中活性中心的水分子参与酶的再生和乙酸的释放，这个过程也涉及氢键的重排。

2010年Belpassi等在JACS发表研究认为，水和氢气的相互作用伴随着电荷转移(Charge Transfer,CT)，CT有很强的立体选择性、各向异性现象，水在不同的方向上既可以充当电子供体也可以充当电子受体。氢气是否可能在氢键网络的形成与电子重排中发挥作用，从而提高酶活性？在生物体系氢气对生物大分子的结构是否有扰动，氢气是否能进入生物大分子内部发挥功能？氢气与AChE的研究中发现氢气可以提高酶的活性，初步表明存在这种可能性。

具有催化三联体结构的丝氨酸水解酶类是一个大的家族，AChE、丝氨酸蛋白酶等都属于这类酶。AChE属于α/β水解酶折叠蛋白超家族，这个家族是成员最多的结构相关蛋白组之一(Lenfant et al.,2013)。它们共同的结构特征就是具有催化三联体结构。我们关于氢气和AChE的研究，是第一次报道氢气和酶分子之间可以直接相互作用，提高酶活性。这为解释氢的生理意义提供了一种新的机制，也提示氢分子可能影响更多的生化反应。

氢气对AChE酶活影响的研究后，我们尝试利用量化计算研究氢气在酶的活性中心的反应细节，遇到了一些困难没有深入下去，也希望感兴趣的朋友将来可以一起探讨。

乙酰胆碱酯酶从研究的操作层面并不是一个好的模型，为了更方便地研究酶与氢气的相互作用，我们选择辣根过氧化物酶（Horseradish peroxidase，HRP）作为研究对象。HRP是以铁卟啉为辅基的血红素蛋白，同类蛋白包括细胞色素氧化酶（线粒体复合物Ⅳ）、过氧化物酶、细胞色素P450超家族、一氧化氮合酶等众多重要的生物酶，这类酶的活性中心含有铁卟啉，在含有过氧化氢的溶液中酶的活性中心可以产生氧化性强的高价铁自由基中间态，很容易通过光谱的方法捕捉。

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温馨提示：根据《食品药品监督管理条例》，氢气不能替代药物治疗。