细胞凋亡检测方法汇总

细胞凋亡，以前也称细胞程序性死亡，是指在一定的生理或者病理条件下，细胞主动的、高度有序的、自己结束其生命的过程。细胞凋亡是生物体中一种普遍存在的现象，胚胎形成、个体发育、衰老和损伤细胞的清除等都与细胞凋亡密切相关。检测细胞凋亡的方法很多，如电子显微镜或者光学显微镜下的形态学观察、细胞DNA提取物的DNA梯状带电泳实验等。而流式细胞术是非常重要的检测细胞凋亡的方法，不仅可以定性，也可以定量。

细胞凋亡可分为早期凋亡（细胞膜结构发生变化，磷酯酰丝氨酸外翻）、早中期凋亡（细胞质密度增加，线粒体膜电位消失，通透性改变，释放细胞色素c、到胞浆）、中晚期凋亡（细胞凋亡的信号转导）、晚期凋亡（DNA降解为180-200bp片断）。

细胞凋亡的流式检测方法汇总：下面我们一一进行介绍。

一、用的最多的Annexin V /PI双染色法检测早期凋亡

正常细胞膜的磷脂分布是不对称的，活细胞中磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine, PS)位千细胞膜的内表面，细胞凋亡时，细胞膜发生变化， PS从细胞膜的内表面翻转到细胞膜的外表面。Annexin V是一种对PS有高度亲和力的、钙依赖性的磷脂结合蛋白，Annexin V可以特异性地识别凋亡细胞表面的PS, 而活细胞的PS位千细胞膜的内表面，无法与Annexin V特异性结合。所以可以用FITC偶联的annexin V鉴别凋亡细胞和活细胞。

坏死细胞的PS也会从细胞膜的内表面翻转到细胞膜的外表面，Annexin V也能识别坏死细胞表面的PS, 所以Annexin V无法区分坏死细胞和凋亡细胞。而PI染料能够与细胞内的DNA结合，区分坏死细胞和活细胞。早期凋亡细胞和活细胞的细胞膜仍然完整， PI染料无法自由通过细胞膜进入细胞内与DNA结合，所以PI染料无法标记凋亡细胞和活细胞，而PI染料却能够通过坏死细胞的细胞膜与细胞内的DNA结合，坏死细胞内PI染料被488nm激光激发后会发射红荧光，被相应通道接收。所以Annexin V和PI同时使用，就可以区分活细胞、早期凋亡细胞和坏死细胞。

操作方法（以悬浮细胞为例）

1、细胞在培养板中培养一定时间后，收集细胞于1.5EP管中，4°C，350g离心5min，弃上清，用500ul预冷的PBS洗涤细胞2次；

2、分别加入5μl AnnexinV+5μlPI +95μl AnnexinV Bind Buffer（含钙离子的缓冲液）重悬细胞，室温、避光20min;

3、向每个管中加入200μl的AnnexinV Bind Buffer,尽快上机检测。

4、对照组的设置：

（1）空白对照：诱导凋亡的细胞不加荧光剂，用来调电压；

（2）单染对照：只加PI或AnnexinV（FITC），用来调节补偿；

（3）阳性对照：诱导凋亡的细胞加本次实验的所有荧光试剂，确认试剂、仪器、操作没有问题；

（4）阴性对照：正常细胞加本次实验的所有荧光试剂，确认细胞正常状态，排除假阳性。

5、上机操作时也是先调节电压，再调节补偿。

结果分析

横坐标为AnnexinV强度，纵坐标为PI强度，对AnnexinV来说，十字门左边是阴性细胞群，右边是阳性细胞群；对PI来说十字门上边是阳性细胞群，下边是阴性细胞群。

实验要点

（1）贴壁细胞如何处理？

对于贴壁细胞，凋亡染色，用不含EDTA的0.25%胰酶消化成单细胞悬液即可，其他参考悬浮细胞操作方法，控制消化时间，过渡消化会损伤细胞。

（2）做流式凋亡是否需要调节补偿？

如果使用的是相邻通道的荧光素，要调节补偿。

（3）冻存过的细胞样本，还可以做流式凋亡检测吗？

不建议采用冻存过的细胞样本，尽量使用新鲜的样本。

（4）保证细胞活性，避免用力吹打，预冷PBS清洗，缩短上机时间，可上机前5min再加PI；

（5）血小板含有PS，能与AnnexinV结合，故需除去

（6）结果分析需依据对照比较

二、细胞凋亡---线粒体膜电位检测

JC-1是亲脂性阳离子荧光染料可结合到线粒体基质，其荧光的增强或减弱说明线粒体内膜电负性的增高或降低。正常生理状态下，线粒体负电性高，JC-1进入线粒体以多聚体存在，红色荧光强，细胞凋亡时，线粒体去极化产生，负电性降低，JC-1则以单体存在细胞质，绿色荧光增强。

实验要点

（1）37°C 培养箱中孵育；

（2）JC-1工作液现配现用；

（3）PH的变化影响膜电位，保持平衡染液中PH的一致性；

（4）JC-1会与蛋白结合，降低燃料的浓度，引起假去极化；

（5）用补偿微球或借用FITC-PI的补偿。

三、细胞凋亡—活化的caspase-3检测

活化的caspase-3由其前体裂解的一个17KD亚单位和一个12KD亚单位组成，形成异二聚体，可被Anti-Active Caspase-3抗体特异性识别。用荧光素标记Anti-Active Caspase-3抗体即可检测到活化的Caspase-3。

实验流程（以悬浮细胞为例）

1、细胞在培养板中培养一定时间后，收集细胞于1.5EP管中，4°C，350g离心5min，弃上清，用500ul预冷的PBS洗涤细胞2次；

2、固定细胞，洗涤之后加入破膜剂（破胞膜）；

3、加入荧光素标记Anti-Active Caspase-3抗体，进行胞内抗体染色，室温30min；

4、加破膜剂洗涤之后，FACS buffer重悬细胞，流式上机检测。

结果分析

横坐标为活化的Caspase-3强度，活化的Caspase-3阳性的细胞即为发生凋亡的细胞（红色部分）。

实验要点

（1）固定破膜之后细胞会损失，前期可以多收集一些细胞。

四、细胞凋亡—DNA片段化的检测

细胞凋亡时染色质发生浓缩, 染色质DNA在核小体单位之间的连接处断裂, 形成180~200bp及其整数倍的寡核苷酸片段,。DNA一旦发生片段化，在DNA双链结构上会出现很多缺口，可以使用FITC标记的DUTP或BrdU在酶的作用下掺入到缺口中，然后检测掺入的信号强度，来判断发生片段化的程度。

实验流程：跟上面提到的步骤差不多，在此不做赘述。

固定-洗涤-FITC-dUTP染色-洗涤-PI/Rnase染色-上机检测

结果分析

横坐标为DNA含量，纵坐标为Brdu强度，Brdu阳性的细胞即为发生凋亡的细胞。