MTT试剂实验方法及技巧

⒈选择适当的细胞接种浓度。一般情况下，96孔培养板的一内贴壁细胞长满时约有105个细胞。但由于不同细胞贴壁后面积差异很大，因此，在进行MTT试剂试验前，要进行预实验检测其贴壁率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线，确定试验中每孔的接种细胞数和培养时间，以培养终止致细胞过满。这样，才能MTT试剂结晶形成酌量与细胞数呈的线性关系。否则细胞数太多敏感性降低，太少观察不到差异。

⒉**浓度的设定。要多看文献，参考别人的结果再定个比较大的范围先初筛。根据自己初筛的结果缩小浓度和时间范围再细筛。切记！否则，可能你用的时间和浓度根本不是**的有效浓度和时间。

⒊ 时间点的设定。在不同时间点的测定OD值，输入excel表，后得到不同时间点的抑制率变化情况，画出变化的曲线，曲线什么时候变得平坦了（到了平台期）那个时间点应该就是好的时间点（因为这个时候的细胞增殖抑制表现的明显）。

⒋培养时间。200ul的培养液对于10的4～5次方的增殖期细胞来说，很难维持68h，如果营养不够的话，细胞会由增殖期渐渐趋向G0期而趋于静止，影响结果，我们是在48h换液的。

⒌MTT法只能测定细胞相对数和相对活力，不能测定细胞数。做MTT时，尽量无菌操作，因为**也可以导致MTT比色OD值的升高。

⒍理论未必都是对的。要根据自己的实际情况调整。

⒎实验时应设置调零孔，对照孔，加药孔。调零孔加培养基、MTT试剂、二甲基亚砜。对照孔和加药孔都要加细胞、培养液、MTT、二甲基亚砜，不同的是对照孔加溶解**的介质，而加药组加入不同浓度的**。

⒏避免血清干扰。用含15%胎牛血清培养液培养细胞时，高的血清物质会影响试验孔的光吸收值。由于试验本底增加，会试验敏感性。因此，一般选小于10%胎牛血清的培养液进行。在呈色后，尽量吸净培养孔内残余培养液。