载体构建和细胞建系流程

设计完sgRNA之后，就可以选择性克隆到此目的载体了。在这里我们选择lentiCRISPR v2载体作为例子说明。lentiCRISPRv2是张锋实验室发布一个慢病毒载体系统，cas9和sgRNA表达框在同一载体上。而且Cas9的C端带有FLAG融合标签，载体包含Puromycin抗性基因，适合建稳转系（图21）。验证sgRNA活性的时候也适合顺转；包装成慢病毒适合常规细胞系的建系。构建非常方便。该载体具体特征如下：

克隆gDNA使用BsmBI位点，载体可以切出一个~1.9 kb的filler片段，便于确认酶切成功并利于载体回收（图22）；

虚拟酶切示意图。Lane1是BsmBI酶切的虚拟结果；lane3是对照

1   BsmBI的位点是CGTCTC(1/5)^，别序列和切割序列分离，酶切之后不需要CIP脱磷也不会自连！

2   Cas9的COOH 端带有FLAGtag,可以WB或者Immunostaining；

3   EFSpromoter被优化的小而强，极大提高了慢病毒包装的效率；

4   载体带有Puromycin抗性，可以富集转染/感染成功的细胞。

具体克隆步骤如下：

1.   克隆到lentiCRISPRv2载体的sgRNA格式如下（图23）：

lentiCRISPR v2载体兼容的sgRNA格式。

举个实例说明（图24）：我们锁定NGG之后，只需跟前上游20 bp的序列设计如图所示的oligo即可。

lentiCRISPR v2载体兼容的sgRNA格式实例。最上面是对应的基因组双链，我们确定NGG之后只需要在前面找到20bp序列即可。

1.   然后合成如下两条引物（oligo）即可(注意方向)：

Oligo1: CACCG/CAGTCTGATCAGTTTTCCTT

Oligo2: AAACAAGGAAAACTGATCAGACTGCCGTCAGACTAGTCAAAAGGAACAAA

3.   然后按照如下步骤退火（图25）

oligo退火步骤

　4　连接到目的载体即可（图26）

连接体系

5.   载体构建好以后中抽就可以包装病毒或者直接转染目的细胞进行编辑了。步骤如下（图27）.

1)   Day1：转染。

2)   Day2：传细胞到100 mm dish；

3)   Day3：加入puromycin筛选，工作浓度可以参考下面的链接http://www.sigmaaldrich.com/china-mainland/zh/life-science/functional-genomics-and-rnai/shrna/learning-center/lentivirus-cell-line.html

4)   Day7-8：阴性对照刚刚死光，取实验组1/2细胞基因组抽提做PCR测序鉴定套峰（图27）或者T7E1（图28），另1/2 keep待用（不加puromycin培养）。

CRISPR编辑之后的mix经PCR测序产生的套峰示意图。套峰的位置一定要对应sgRNA的位置（图中红色框）。根据套峰的“复杂度”可以大概估计编辑效率，精确的比例可以通过TA克隆来计算；或者通过T7E1实验来定量编辑效率。

CRISPR编辑之后的mix经PCR-T7E1实验。根据切割条带灰度可以定量切割效率。

6.   单克隆的挑取---keep的1/2细胞可以有限稀释到96-wellplate（～30cells/plate）（293T、HeLa、MEF等细胞系推荐使用）。如果编辑效率50%，推荐分两块plate即可，最终拿到20-30个单克隆一般可以得到成功KO的细胞系；或者铺到100 mm dish里，一周后挑取单克隆（这种方法适合单细胞不容易成活的细胞系如，但是挑取的单克隆偶尔不纯，有时需要重新亚克隆）（图29）。（注：如果载体带有GFP等荧光标记，还可以通过流式细胞仪直接分选，把单个细胞种到孔板种从而直接得到单克隆。）

单克隆获取的两种常用方法-有限稀释和单克隆挑取

　7　单克隆长起来之后就可以抽取genomic DNA，鉴定.常见的鉴定方法如下：

CRISPR成功编辑单克隆的鉴定。常见的鉴定方法包括三种：a，单克隆直接PCR测序，可以直观看到编辑位点的DNA序列，这是最精确的方法；b，编辑位点跨过某个内切酶位点的可以用PCR-酶切的方法来判断，这是最简便的方法；c，WB鉴定，用抗体直接鉴定目的蛋白是否消失，如果抗体条带特异，还可以简化为dot blot。这是最彻底的方法。但不管哪种方法，最终获得的克隆都需要经过测序弄清楚具体序列的改变