实时定量PCR中的常见问题及解决办法

　　1、反应后无扩增曲线出现

　　1）确认程序中是否设置了信号采集步骤：两部法扩增程序一般将信号采集设置在退火延伸阶段；三步法扩增程序应当将信号采集设置在72℃延伸阶段。

　　2）扩增效率问题：电泳检测realtimePCR反应产物，观察是否有正确大小的目的条带出现。如果没有，则逐一排查引物、模板以及反应条件问题。

　　3）循环数不够：一般可设置循环数为40。

　　2、Ct值出现太晚

　　1）模板浓度过低或模板降解：重新制备模板再进行实验。

　　2）扩增效率低：优化反应条件，或者重新设计PCR引物。

　　3）PCR产物过长：一般设计为100-200bp即可。

　　4）反应体系中含有抑制剂：常在模板质量不高时出现，重新制备模板或将模板稀释后使用。

　　3、扩增曲线形状异常

　　1）扩增曲线不光滑：信号太弱，经系统矫正后产生。提高模板浓度重复实验。

　　2）扩增曲线断裂或下滑：模板浓度较高，基线的终点值大于Ct值。减小基线终点 (Ct值- 4)，重新分析数据。

　　3）个别扩增曲线突然骤降：反应管内留有气泡，由于温度升高后气泡破裂，使仪器检测到的荧光值突然降低所致。进行扩增反应之前要仔细检查反应管内是否有气泡残留。

　　4、阴性对照出现扩增曲线

　　1）阴性对照在35个循环以后出现扩增曲线很有可能是因为出现引物二聚体，属于正常现象。可通过融解曲线分析进行判断。

　　2）反应体系被模板污染：更换水、反应试剂、引物。

　　5、标准曲线线性关系不佳

　　1）加样误差：将模板稀释，扩大体积是一个有效的解决办法。

　　2）标准品降解：重新制备标准品。

　　3）模板浓度过高：稀释模板重新实验。

　　6、实验重复性差

　　1）加样误差：将模板稀释，扩大体积是一个有效的解决办法。

　　2）模板浓度太低：模板浓度越低，重复性越差。适当增加模板量。

　　3）仪器误差：不同的孔温度控制不一致也会导致重复性差的问题。请专业人员对仪器进行校准。

　　7、融解曲线出现多峰

　　1）引物非特异扩增：重新设计引物，优化扩增条件。

　　2）引物浓度太高：引物浓度过高容易引起扩增条带弥散。适当降低引物浓度。

　　3）cDNA模板基因组DNA污染：重新制备cDNA。在RNA提取完成后加入DNase对RNA进行处理。

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