IHC实验问题总结及处理方法

Q1：边缘效应?

1）组织边缘与玻片粘贴不牢，边缘组织松脱漂浮在液体中，每次清洗不易将组织下面试剂洗尽所致. 解决办法：制备优质的胶片（APES或多聚赖氨酸），切出尽量薄的组织切片，不厚于4微米，组织的前期处理应规范，尽量避免选用坏死较多的组织。

2）切片上滴加的试剂未充分覆盖组织，边缘的试剂容易首先变干，浓度较中心组织高而致染色深。解决办法：试剂要充分覆盖组织，应超出组织边缘2mm。用组化笔画圈时，为了避免油剂的影响，画圈应距组织边缘3-4mm。

Q2：产生组织切片非特异性染色的原因有哪些？如何解决？

1） 抗体孵育时间过长、抗体浓度高易增加背景着色。这可通过缩短一抗/二抗孵育时间、稀释抗体来控制。这是最重要的一条。

2） 一抗用多克隆抗体易出现非特异性着色，建议试用单克隆抗体看看。

3） 内源性过氧化物酶和生物素在肝脏、肾脏等组织含量很高（含血细胞多的组织），需要通过延长灭活时间和增加灭活剂浓度来降低背景染色；

4） 非特异性组分与抗体结合，这需要通过延长二抗来源的动物免疫血清封闭时间和适当增加浓度来加强封闭效果；

5）  DAB孵育时间过长或浓度过高；

6） PBS冲洗不充分，残留抗体结果增强着色，在一抗、二抗或SP孵育之后的浸洗尤为重要；

7）  标本染色过程中经常出现干片，这容易增强非特异性着色。

Q3：免疫组化染色呈阴性结果的原因有哪些？

1）抗体浓度和质量问题以及抗体来源选择错误。不是抗体浓度越高就越易出现阳性结果，抗原抗体反应有前带和后带效应，必须摸索最佳浓度。

2）抗原修复不全，对于甲醛固定的组织必须用充分抗原修复来打开抗原表位，以利于与抗体结合;建议微波修复用高火4次*6min试试。有人做过实验，这是最佳的时间和次数。若不行，还可高压修复。

3）组织切片本身这种抗原含量低；

4）血清封闭时间过长。

5）DAB孵育时间过短。

6）细胞通透不全，抗体未能充分进入胞内参与反应。

7）开始做免疫组化，一定要首先做个阳性对照片，排除抗体等外的方法问题。

Q4：背景强的原因?

1）考虑一抗浓度高；

2）然后调整DAB孵育时间；

3）也要考虑血清封闭时间是否过短

4）适当增加抗体孵育后的浸洗次数和延长浸洗时间等。

Q5：石蜡切片在染色过程中出现脱片现象？

1）烤片时间不够，或温度不够，可以延长烤片时间和提高烤片温度

2）用含有多聚赖氨酸的玻片，可以购买到或这自己做

3）有些组织本身就容易掉片，如骨组织等，操作时冲PBS不要直接冲到组织上，冲到组织上方，让它流下冲洗组织，

4）用高温修复时，温度骤冷也可能引起。

Q6： 一抗从4度拿出后，为什么要进行37度复温？

1） 一方面，防止切片从4度直接放入PBS易脱片；

2） 另一方面，使抗原抗体结合更稳定。一般不需要，但对表达较弱的抗原可能有用，4度和37度时分子运动方式不同，前者分子碰撞机率和运动速度小于后者，后者结合更快，但敏感性也提高了并易造成非特异染色。

Q7：切片染色后背景太深，如何区分特异性与非特异性着色？

全片着色是指整个切片全都染上了颜色，着色的强度可深可浅，总之，分不清那些组织是阳性那些组织是阴性。出现这种现象的原因有：

1）抗体浓度过高：一抗浓度过高是常见的原因之一。解决办法是，每次使用新抗体前应当对其工作浓度进行测试，使每一抗体个体化，找到适合自己实验室的理想工作浓度，既使是即用型的抗体也应如此，不能只简单的按说明书进行染色。

2）抗体孵育时间过长或温度较高：解决办法是，严格执行操作规程，最好随身佩带报时表或报时钟，及时提醒，避免因遗忘而造成时间延长。现在流行的二步法（Polymer）敏感性很高，要求一抗孵育的时间不是传统的1小时，而是30分钟，因此，要根据染色结果进行调整。

3）DAB变质和显色时间太长：DAB最好现用现配，如有沉渣应进行过滤后再用。配制好的DAB不应存放时间太长，因为在没有酶的情况下，过氧化氢也会游离出氧原子与DAB产生反应而降低DAB的效力，未用完的DAB存放在冰箱里几天后再用这种似乎节约的办法是不可取的。DAB的显色最好在显微镜下监控，达到理想的染色程度时立即终止反应。不过当染色片太多时或用染色机时，这样做似乎不现实，但至少应对一些新的或少用的抗体显色时进行监控，避免显色时间过长。

4）组织变干：修复液溢出后未及时补充液体、染色切片太多、动作太慢、忘记滴液、滴液流失等都是造成组织变干的原因。解决的办法是操作要认真仔细，采用DAKO笔或PAP Pen在组织周围画圈，可以有效的避免液体流失，也能提高操作速度。

5）切片在缓冲液或修复液中浸泡时间太长（大于24小时）：原因上不清楚，但现象存在。有的实验室喜欢前一天将切片脱蜡至修复，第二天加抗体进行免疫组化染色，如果将装有切片和修复液的容器放在4ºC冰箱过夜，对结果无明显影响，如果放在室温，特别是炎热的夏天，会出现背景着色，因此，不可存放时间太长。

6）一抗变质、质量差的多克隆抗体：注意抗体的有效期，过期的抗体要麽不显色要麽背景着色。用新买的抗体时最好设立阳性对照和用使用过的抗体作比较。

Q8：脱片产生的原因有哪些？

1）多聚赖氨酸玻片质量的问题。

2）组织切的不好，切片机的问题例如比较老的旧的机器切的厚或者不均匀，或者切片者手法不好等。

3）没烤好，时间短，温度不够之类。

4）操作的时候甩的太猛了，有脱片嫌疑的片子最好不甩或轻轻甩，用卫生纸从边缘上慢慢吸水。

5）修复的问题：抗原修复的时候高压时间过长了，或者放进100度的修复液时手法不好，咚的一声就丢进去了，这样超容易脱片。此外，用EDTA修复比柠檬酸容易脱片，但是你要用到EDTA的时候也没办法，只有从另外的问题上着手。

6）一旦见到有组织漂起来操作就更加要谨慎，用PBS的时候尽量用泡的，不要冲。基本上把这些方面都注意到了，能改善的尽量改善，脱片可以减少很多。

7）组织的问题，我用的组织癌症的很多，越是癌症组织有坏死之类越容易脱。

Q9：DAB显色后发现切片着色不均匀：如一片着色，一片不着色或染色浅？

1）切出的片子厚度本身可能就不一样，切出一片厚，一片薄，这样可能造成着色深浅不一。

2）有可能是你 显色液底物加到片子上后没有摇匀，造成局部底物浓度不一致，所以加完显色液后最好将片子来回左右晃动几下，使片子上所有区域的底物浓度一致。

3）如果你的片子是中间的染色深，靠近边上的浅，那有可能是你蜡圈画的太小，显色液覆盖的面积不过大而产生了边缘效应。最外侧的组织片最好离显色液外缘0.5 cm。

Q10：染色过强

1）抗体的浓度过高或抗体孵育时间过长降低抗体滴度（一般指浓缩性抗体）；

2）孵育温度过高；

3）DAB显色时间过长或DAB浓度过高，显色时间不能超过5-10分钟，以显微镜下观察为准。

Q11：非特异性背景染色

1）操作过程中冲洗不充分；

2）组织中含过氧化物酶未阻断 ，可再配置新鲜3%H2O2封闭，孵育时间延长；

3）组织中含内源性生物素，可用正常非免疫动物血清再封闭；

4）血清蛋白封闭不充分，可延长血清蛋白封闭时间。

Q12：染色弱

1）抗体浓度过低，孵育时间过短，可提高抗体浓度，孵育时间不能少于60分钟；

2）试剂超过有效使用期 及时更换试剂；

3）操作中，滴加试剂时缓冲液未沥干，致使试剂稀释，可每步滴加试剂前沥干切片中多余的缓冲液（但防止切片干燥）；

4）室温太低，低于15℃ 若室温低于15度，要改放在37℃孵育箱孵育30-60分钟（或4℃冰箱过夜）；

5）蛋白封闭过度，封闭时间不要超过10分钟。

Q13：染色阴性

1）操作步骤错误 重新试验，设立阳性对照；

2）组织中无抗原 设立阳性对照片，以验证实验结果；

3）一抗与二抗种属连接错误 仔细确定一抗与二抗种属无误。