许国旺：代谢组学方法学和临床应用研究应该双翼齐飞

　　分析测试百科网讯 在各种多组学中，代谢组学研究是后起之秀，但近年来进入转化医学和精准诊疗的速度很快。代谢组学究竟是如何发展起来的？为何转化到临床应用的速度更快？未来的发展趋势如何？近日，分析测试百科网采访了中国科学院大连化学物理研究所、代谢组学研究中心主任许国旺研究员，希望他的探索和系统的阐述能够激励更多的研究者开展代谢组学研究，并将其推进到精准诊疗的广阔天地……

中国科学院大连化学物理研究所代谢组学研究中心主任许国旺研究员

　　“代谢组学的临床应用其实最早出现在70年代初”，许国旺的回顾让我们大长见识。上世纪七十年代初， 质谱（MS）方法开始应用于新生儿代谢的出生缺陷检查，是最早的代谢组学临床应用。随着基因组计划的实施和完成，出现了蛋白质组学，同时对代谢物的作用有所忽视。一直到上世纪末期人们开始重新意识到：代谢物在生化网络中起着非常重要的作用，科学家们才重新回过头来研究小分子。2001年开始，代谢组学得到快速发展。

　　在代谢组学的发展过程中，我国的研究基本和国际同步。2004-2005年前后，以大连、上海、武汉、北京等地的一些单位的研究为代表，推动中国代谢组学的发展。“2002年我曾在上海生化细胞所做代谢组学报告，听会的人不是特别多；2003年年底，中国科学院在上海生命科学院召开了关于'植物、微生物代谢组学和代谢工程’学术研讨会，本人受邀做了题为'植物、微生物代谢组学技术平台的研究’的报告，会场座无虚席，与会科研人员和青年学生对代谢组学所表现出的热情与2002年的情景形成鲜明对比。”

　　代谢组学是研究分子量1500以下的内源性小分子的科学，应用覆盖疾病诊断、机理研究等各方面。此前人们认为代谢物是末端产物，没有什么功能了；现在发现代谢物与同基因、蛋白同等重要的、构筑生命体的模块；在核酸、蛋白生化作用的过程中，小分子也参与了调控。从文献来看，上世纪50年代研究小分子代谢的文章很多，但到80-90年代发一篇CNS很难；本世纪初开始改观，尤其是最近5年，CNS每周均有小分子的文章发表，表明人们越来越重视代谢组学、小分子功能、小分子调控。

不识庐山真面目 只缘身在此山中

　　谈到自己和代谢组学的结缘，许国旺说：“1995年我拿到德国马普研究基金到德国工作，最早我从事气相色谱研究，当时想转生命科学方向，就申请到德国Tuebingen大学医学院工作。医学院根据我原来研究色谱的背景，安排我研究尿中代谢产物同恶性肿瘤发生发展的关系。在德国工作两年回国后，我们课题组就开辟了新方向：研究代谢同健康的关系。”

　　“我们最初用毛细管电泳、液相色谱开展研究，渐渐开始用GC-MS、LC-MS，但未想到这正是代谢组学的前奏。2001年在同中国科学院上海生科院吴家睿副院长交流时，他告诉我一个非常新的名字，即代谢组学。那是我第一次听到这个名词，到网上查到Jeremy Nicholson在1999年定义了metabonomics（代谢组学）概念的文献，才知道我们的工作已经踏入了这个热点新兴领域的大门。”

披荆斩棘 开路先锋

　　那时全球都没有代谢组学的专用仪器，沃特世（Waters）是介入最早的公司。2003年沃特世（日本）的一位经理想邀请许国旺在中国组织一个研讨会，但筹备数月后离职了。一年多后，沃特世（中国）的舒放经理和许教授再联系，2004年10月在上海举办了中国第一次代谢组学研讨会。彼时中国的代谢组学研究刚刚萌芽，因此定位于高层研讨会。在杨胜利院士的帮助下，许国旺出面邀请了可能会对代谢组学感兴趣的国内参会专家。除许国旺本人外，代谢组学先驱英国帝国理工学院的Jeremy Nicholson教授和美国Waters公司代谢组学专家Robert Plumb博士，都在会上作了精彩讲演。

　　许国旺继续回忆到：“2004年会议后代谢组学在中国慢慢热起来。大连化物所和沃特世成立了'代谢组学联合实验室’，2004年7月我受邀到新加坡在代谢组学研讨会上做报告。2004~2005年沃特世推出第一台专门用于代谢组学的质谱仪Q-TOF Micro MS，我们实验室成为他们的第一个中国用户。后来的几年，我们在上海、大连等地同沃特世联合组织了几次药物代谢组学会议。”

　　“2003-2004年，中科院上海植物所的陈晓亚所长组织了植物代谢组学的项目，我在其中。此时，有的单位也开始申请和使用代谢组学实验室的名称。看来我们也需要立代谢组学的Flag了。”许国旺说。2005年7月，在包信和所长和生物技术部主任杨胜利院士的支持下， 大连化物所挂牌建立“代谢组学研究中心”，并邀请科技部基础司张先恩司长为中心揭幕。后来的几年，中心除了沃特世代谢组专用质谱，也添置了岛津、SCIEX、安捷伦、赛默飞等各公司的质谱，并开展不同的合作。

　　方法学研究

　　代谢组学研究中心有几大研究方向，首先是方法学研究。许国旺所在实验室是中国科学院分离分析化学重点实验室。代谢组学起初只是概念，后来才有专用仪器，彼时的软件、方法都不成熟。因此，课题组从建立方法开始，再开发数据处理软件，自建方法和工具后再回头开展“发现”研究。

　　在方法学上，课题组已建立了几十个方法，从一维到二维，从靶向到拟靶向、到非靶向等各个层次。许国旺打了个比方：“我非常自豪地讲，就像去饭店点菜一样，我们建立了各种专门的方法，来适合于不同的代谢组学分析需求。”

　　许国旺课题组发展了一种拟靶向（Pseudotargeted）的代谢组学方法，将靶向和非靶向相结合， 被国际上多个实验室采用，UC DAVIS的Oliver Fiehn教授称此类方法为第二代代谢组学方法，尤其适合大规模代谢组、脂质组学的分析。目前课题组已建立包含2000多个代谢物的拟靶向代谢组学分析方法和包含19个脂类，3377个脂质离子对，覆盖7000多种脂质分子结构的拟靶向脂质组学分析方法。8年研究的相关结果和软件已发表在Nature Protocols上。

从非靶向（左）向拟靶向（右）脂质组分析的转变示意图

　　代谢组学应用

　　课题组已将代谢组学方法应用于多个领域，如临床、植物、微生物、中医药等。实验证明，临床是代谢组学最有成效的应用领域。课题组同许多三甲医院开展合作研究，如上海东方肝胆医院，上海交通大学附属瑞金医院，上海第六人民医院，上海第九人民医院，哈尔滨医科大学附属第一医院，郑州大学附属第一医院等，并已取得多项研究成果。

　　第一方面是标志物的发现。全球已发表多于150,000个所谓的标志物，但真正在医院用的少于100个。课题组发现了几个有前途的代谢物作为疾病潜在标志物，用于对肝癌风险的预测，糖尿病视网膜病变的预测等，正准备进一步做多中心验证，并申请专门的试剂盒。前些年开发的《血清甘胆酸检测试剂盒-液相色谱/串联质谱法》已获批临床医疗器械证，可在医院使用。

胆汁酸试剂盒

　　许国旺强调说：“我们的平台是开放式的，去年报中国分析测试学会CAIA奖的时候助手统计，先后有上百家单位曾经用我们的平台来开展代谢组学研究，近五年就有约50家单位（/次）。”

许国旺团队“基于液相色谱-质谱联用的高覆盖代谢组学方法开发及应用”荣获2020年度中国分析测试协会科学技术奖（CAIA奖）特等奖

　　第二个方面是治疗，代谢紊乱作为治疗靶点也非常吸引人，去年SCIENCE专门有文章综述此专题。课题组同郑州大学第一附属医院余祖江教授合作，研究治疗慢加急性肝衰竭的方法。该合作重点研究急性肝损伤过程中代谢如何紊乱。发现代谢紊乱的途径，然后找到合适的药物来纠正细胞中的紊乱，增加细胞活力。研究发现，慢加急性肝衰竭患者中主要紊乱是脂肪酸氧化上调，糖酵解下调。根据代谢组学研究结果，余祖江团队用TMZ（曲美他嗪，trimetazidine，可治疗心绞痛）来抑制脂肪酸氧化，让代谢流回归到糖酵解，增加肝细胞活力，从而治疗急性肝损伤。132例随机对照临床实验证明TMZ治疗可显著改善肝衰竭患者的预后。TMZ已获得美国FDA批准享受孤儿药的地位来治疗急性肝损伤，郑州大学第一附属医院已将此作为治疗急性肝损伤的常规方法使病人受益。

　　第三方面是代谢重编程的研究。肿瘤发生发展过程中的明显特征是能量代谢紊乱。肿瘤细胞为了生存和高速倍增，对代谢途径和代谢行为进行重编程。比如肿瘤细胞主要利用糖酵解途径快速提供ATP供自身生长，肿瘤细胞还会消耗大量的葡萄糖并产生大量的乳酸来适应其细胞生长。肿瘤细胞还会根据外界营养物质的浓度和不同的应激条件，选择不同的代谢方式产生供自身使用的ATP和生物大分子。这时候整个代谢网络改变。代谢组学可研究疾病发生发展过程中，代谢的途径、代谢网络如何变化，即代谢重编程。

代谢组学研究和应用的现状

　　谈到方法学，许国旺表示，代谢组学研究的两大主要工具是NMR（核磁共振）和质谱，两者是互补关系。NMR是无损检测，相对比较简单和稳定；但质谱灵敏度更高，比NMR高2-3个数量级，同时具有大量丰富的碎片信息，可以推测结构。

　　代谢组学使用的质谱主要有两类，一类是高分辨质谱，用于“全景式”研究代谢，一般来说，3万以上分辨率的质谱基本可以满足非靶向代谢谱的采集，主要用于“发现”。另一类是三重四极杆质谱，主要用于做精准定量。上述两类质谱可配合使用，实现从发现到验证的代谢组学研究。

　　在“大海捞针”式的发现阶段，高分辨质谱用于尽可能多和全地测出代谢组，再用多变量、单变量方法来筛选出差异代谢物。比较不同组的差异发现差异代谢物是代谢组学研究的核心。但代谢标志物的确定，需要扩大样本，进行多中心、不同人群、干扰疾病等的验证，这时用三重四极杆质谱。

　　代谢组学另一重要目标是研究机理，从代谢层面，开展细胞实验、动物实验、多组学等研究；结合体内体外实验，找出重要的差异代谢物也是关键。将机理研究和标志物发现工作结合的代谢物组学研究成果，将有更大的潜力推广到临床。

　　许国旺强调说：“代谢组学的发现和临床应用是两个不同的阶段，发现阶段大多数是研究过程，步骤复杂并需要高精深技术，需要科研人员来完成。在此基础上，锁定那些有功能的代谢物或代谢标志物，再推广到临床，这是第二步。在发现和临床应用之间还有很多过程，包括扩大样本量、多中心、临床检验方法报批等。代谢组学从研究到临床的路径不短。”

　　许国旺还介绍了脂质组学的知识。首先，脂质组是代谢组的一种，但为什么要单列？这是因为，脂质的结构非常有特点，其分子骨架碳链非常有规律。其次脂肪酸、磷脂、甘油酯等种类也非常多，高达数十万种。最后，脂质组的样品预处理和普通代谢物不同。脂质组学同生理、生化、病理等功能非常密切，同心血管病、糖尿病、肿瘤等疾病密切相关，近年来成为一个独立分支受到研究者重视。PubMed上的一些综述显示，很多心血管病的生物标志物都是脂质，还有一些如ceramide（神经酰胺类)，实际上是细胞生与死的开关，具有非常重要的功能。

　　近十年间，观察PubMed的文献可知，参与到代谢组学领域的人越来越多，文章数量高速上升。这是因为，代谢组学研究的是终端产物，同疾病发生发展过程密切相关。所以Jeremy Nicholson等在《C&EN》（美国化学工程）上发表综述说，用代谢组学研究临床问题，省钱、更接近于解决实际问题。

为什么代谢组学转化为临床应用更快？

　　许国旺表示，近年来代谢组学研究队伍迅速增长，临床上更对代谢组学给予厚望。基因反映疾病发生的基础，蛋白实现功能，基因变化了但不一定发病。比如青少年糖尿病（MOD）是单基因疾病，有些人该基因有突变，但四十多岁时还没有发病，因此说基因突变是发病的必要条件但不是充分条件。从代谢角度来看，如果代谢异常，则指示疾病已发生。因此用代谢组学来研究疾病更接近于实际问题，相对于其他组学更节省成本。

　　关于多组学的标志物进入临床，许国旺表示：“那是苦差事，过程非常漫长，无论哪种组学都非常不容易。”代谢组学的临床应用如新生儿代谢紊乱、出生缺陷，理论上可以筛100余种疾病，但真正临床上做筛选的只有30余种，因为筛选出来需有药物治疗才有意义。当前已进入临床应用的标志物如葡萄糖、胆固醇、同型半胱氨酸、激素、维生素D、肌酐、尿酸等都是代谢物。许国旺认为，标志物临床应用的未来可能是组合标志物，用多组学研究获得的多个标志物组合（panel）诊断一种疾病或评价药物的治疗有效性。特别是，如果将大分子蛋白和小分子代谢物组合在一起，灵敏度和特异性都能提升。因为疾病的发生发展过程不是一个途径，不是一个代谢物或者一个蛋白在起作用，可能整个网络已经改变。所以用Panel检测，在关键网络中找几个标志物，将提升灵敏度和特异性。即在网络医学时代，多标志物检测将是必然趋势。

临床质谱：诊断和研究都很重要

　　谈到临床应用的国内外对比，许国旺表示：临床质谱在中国被描绘为未来千亿的市场，很多投资正进入该领域。未来首先要做到规范化，其次是推动更多的方法得到认可，并真正和健康结合。LDT是实验室自建方法后得到相关部门的认可，但需确保该方法有用。根据产品风险程度由低到高，体外诊断试剂分为第一类、第二类、第三类产品。比如肿瘤诊断一定是III类，要获得国家级认可；除已明确为第一类、第三类的产品，其他为第二类产品，省级认可即可。尽管描绘未来千亿级蓝海市场，但其实现在我国获得医疗器械注册证认可的质谱方法不多。未来需要质谱方法学的研究者和临床检验医生更好地结合，取得医疗器械注册证认可才能让更多质谱方法进临床。

　　许国旺特别强调说，我们谈到的临床质谱不只是针对临床辅助诊断，用质谱还可开展很多临床研究（暨医学研究）。其实，质谱发挥作用最大的领域是质谱作为新的工具进入到临床研究；不能片面认为只有辅助诊断，临床研究可能是更重要的。

　　许国旺认为，临床代谢组学未来的难点和挑战是：第一，如何真正将代谢组学同临床问题结合，去解决临床实际问题。第二，要求扩大样本量，对研究发现的结果进行验证。第三，要做到方法的不可替代性，让方法具有生命力。

　　如何应对上述挑战？许国旺认为：首先，分析化学的研究者要建立可靠、可重复的方法。其次，临床医生要找准问题，找到代谢组学擅长解决的问题来做，两者要结合起来。最后，临床问题要转变成科学问题，分析化学家要与临床医生紧密合作，同时联合生物化学、细胞生物学、临床医学、大数据等才能真正发挥作用及解决问题。

代谢组学需要的硬软件

　　许国旺认为，代谢组学对仪器的要求是稳定和重复。临床样本是不可复制的，在实验原始数据存盘后，有些色谱质谱峰当时无法鉴定，但过几年仪器或方法有新突破后，应可以回头再来挖掘这些数据。

　　代谢组学是一个交叉学科，参与者包括分析化学家、临床医生、分子生物学以及相关数据处理的研究人员。每一领域的进步都将推动代谢组学的进步。在发现阶段，尽可能使用高精尖的仪器，但到医院临床使用时需要的是“傻瓜机”。不排除下列情况：研究阶段用高精尖的质谱，真正应用时同质谱没有关系，如用特异性的光学或免疫的检验方法。代谢组学研究和应用涉及非常长的链条，试剂盒、前处理等各行各业都可参与发挥作用。在临床应用时，质谱法的好处是可以一次检测多个标志物，而且灵敏、准确。

　　代谢组学转化为临床检测当前存在的问题是，理论上医疗器械注册证可以批准多标志物检测的质谱方法，但实际审批时需要讲清楚每个标志物的意义。这样很难，因为可能正是多个标志物共同指示了疾病或共同产生了功能，单个标志物无法说清楚。

代谢组学发展趋势

　　从近几年的发展趋势来看，2010年之前代谢组学研究在概念阶段，很多研究是把原来的一些体系用代谢组学方法运行一遍，来证明代谢组学的可用性。2010年后的10年取得非常明显的进步，代谢组学全面深入临床、药物发现等领域去解决实际问题。当前代谢组学关注两大方向的趋势，一个是大队列人群，因为要解决临床问题用几十个样本是不可能的，需要分析数百到数万个临床样本；并同多组学整合，比如代谢组学同基因组学、转录组学特别是肠道菌群整合研究。另外一大趋势是，在越来越复杂的同时，追求越来越精细化，分析更少量的细胞甚至单细胞，近年来空间转录组学的兴起也促生了空间代谢组学，单细胞代谢组学成为非常大的热点。

　　除了将代谢组学研究逐渐转化到临床应用，当前还可以用实时原位质谱技术指导手术过程，比如判断是否是肿瘤组织、如何切除，代谢组学干预手术进程的方法越来越多，这是非常前沿的工作。在从标志物发现、验证、临床报批方面，也涌现越来越多的应用。在药物开发过程中，毒性研究结果对最后的新药成败影响甚大，代谢组学可在药物研究初期就介入毒性研究，进一步减少风险，辅助药物开发进程，比如英国联合全球几大制药公司组织了COMET项目。在药物开发早期用代谢组学介入减少毒性，淘汰不良药物，控制开发风险，取得很大成功。

未来规划

　　总结展望代谢组学的发展，许国旺表示，首先是一定要能解决实际问题；其次是向两头延伸：一头做大队列人群的验证，另一头做单细胞、亚细胞研究。从单细胞到人群，并同大健康结合，研究环境、遗传、生活方式等对健康的影响，然后用细胞、动物来研究机理。

　　课题组未来的研究重点也将结合上述趋势，发挥特长让质谱发挥作用。关注代谢物发现、代谢重编程，特别是同临床医生结合，通过研究切实帮助病人，让病人受益。